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研究目的缺血性脑卒中(Ischemic stroke)是严重威胁人类身心健康的脑血管疾病,发病率一直高居不下,目前仍处上升趋势。众所周知,缺血性脑卒中除溶栓外无特异有效的预防以及治疗方法,而溶栓后会进一步造成脑缺血-再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI),其机制非常复杂。研究发现在 CIRI过程中存在ERK1/2信号通路的激活。另报道Orexin-A是主要由下丘脑分泌的一种神经肽,通过其与G-蛋白偶联受体结合抑制脑梗死体积,对CIRI具有神经保护作用,然其作用机制尚需进一步研究。因此,本课题将探讨Orexin-A如何通过影响ERK1/2信号通路对CIRI发挥神经保护作用,为探索延缓或阻止CIRI神经损伤提供有效策略,为临床应用提供理论依据和实验基础,以期减弱缺血-再灌注损伤,挽救缺血半暗带神经元,从而改善行为和认知功能。研究方法选用SPF级wistar大鼠制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型以及体外培养SH-SY5Y细胞制备氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型。采用随机数字法将大鼠分为假手术组(Sham)、模型组(I/R)、建模后Orexin-A单独干预组(OXA)、建模后Orexin-A和SB334867共同干预组(SB+OXA)以及建模后PD98059单独干预组(PD)。SH-SY5Y细胞体外实验分组:对照组(Control)、模型组(OGD/R)及建模后Orexin-A干预组(OXA)、Orexin-A 和 SB334867 共同干预组(SB+OXA)和 U0126 干预组(U0126)。大鼠造模前需禁食12小时,造模并干预完成后取皮层组织进行检测。首先对建模后p-ERK1/2的表达差异进行检测,以验证CIRI的发生发展过程确实伴有ERK1/2的激活;利用Orexin-A对于模型组进行干预,验证其神经保护作用以及对p-ERK1/2的表达影响;利用SB334867先于Orexin-A对模型组进行干预,检验Orexin-A的保护作用是否减弱或者消失,以验证Orexin-A通过OX1R发挥作用;选择p-ERK1/2的抑制剂对于模型组进行单独干预,检测p-ERK1/2的表达受到抑制对于CIRI的影响。采用逆转录PCR、蛋白质印迹等技术检测各处理组p-ERK1/2和OX1R在基因以及蛋白水平的表达差异;采用TTC染色实验检测各组大鼠脑梗死体积的差异;Tunel染色实验检测细胞凋亡情况;贴条实验和平衡木行走实验检测各处理组大鼠运动和感觉的差异。研究结果1.大鼠MCAO再灌注损伤和氧糖剥夺后复氧处理后均可诱导p-ERK1/2的高表达(p＜0.01,p＜0.05),表明 ERK1/2 的激活参与了 CIRI。2.Orexin-A干预可降低大鼠脑梗死体积(p＜0.05),降低细胞凋亡率(p＜0.01,p＜0.05),表明Orexin-A具有神经保护作用;同时Orexin-A可以降低p-ERK1/2的高表达(p＜0.01,p<0.05)。3.基于OX1R在大鼠MCAO再灌注损伤和氧糖剥夺后复氧处理后在基因和蛋白水平表达均增高,选择OX1R拮抗剂SB334867进行干预,与Orexin-A单独干预组相比,SB334867共同干预后,大鼠脑梗死体积变大(p＜0.01,p＜0.05),细胞凋亡率增高(p＜0.05),p-ERK1/2的表达增高(p＜0.01,p＜0.05),结果表明SB334867阻断或者部分阻断了 Orexin-A的神经保护作用。4.ERK1/2的抑制剂PD98059和U0126对体内外模型组进行干预,与模型组相比,干预后大鼠脑梗死体积变小(p＜0.05),细胞凋亡率降低(p＜0.05),结果表明ERK1/2活性的降低具有保护作用。研究结论CIRI可以激活ERK1/2通路,Orexin-A通过与OX1R的结合,降低ERK1/2磷酸化,降低大鼠脑梗死体积和细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。ERK1/2抑制剂阻断ERK1/2通路后,大鼠脑梗死体积和细胞凋亡率均降低。本研究有助于探讨Orexin-A/OX1R系统对脑卒中的调控作用和干预机制,为研究脑卒中的发病机制和治疗方法奠定理论与实验基础,为探寻新的药物靶点和新的治疗策略提供实验依据。