在人口激增的今天,世界范围的粮食危机越来越严重;石油、煤炭等矿物能源日渐枯竭,因此,寻找可再生的替代能源已成为全人类迫在眉睫的课题。天然纤维素拥有可再生、产量大、环境友好等特点,被人们认为是解决这些危机的希望。但目前国内外在利用生物降解的方法来利用纤维素方面均存在酶活性低、酶的种类相对较少等问题。寻找和开发高活力、广底物、耐高温高碱等极端条件的新型纤维素酶,对于纤维素酶的开发利用具有重要的工业价值和社会价值。在纤维素酶系水解纤维素的过程中,β-葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖和低分子量的纤维寡糖为葡萄糖:同时,β-葡萄糖苷酶作为酶制剂生产应用也有非常重要的作用。因此研究和开发新型高效β-葡萄糖苷酶具有十分重要的意义。据分析,由于环境样品的微生物中99%以上的类群是未被培养而没有得到人们的认识,开发这些未能培养的微生物及其基因资源已成了近年来国际上的研究热点。目前已经建立起一条研究开发这些未能培养微生物的途径,即宏基因组学研究。宏基因组学以环境中所有微生物基因组为研究目标的微生物研究方法,通过扩增测序、总基因组文库的构建和测序分析,可以获得大量的关于未知微生物的有用信息。兔盲肠肠道里聚集着大量能分泌纤维素酶的微生物群体,但由于传统纯培养技术造成对这些环境内微生物研究利用的局限,对其内部的纤维素降解相关基因的研究就存在极大的空间。本研究基于β-葡萄糖苷酶的重要价值和开发兔盲肠新型纤维素酶类基因前景的广阔性,采用宏基因组学研究手段,构建兔盲肠内微生物宏基因组DNA文库,从中成功筛选获得一个新的与纤维素降解相关的基因β-葡萄糖苷酶基因nglu007,并且对其相应酶进行了酶学性质分析。主要结果如下。一、兔盲肠内微生物宏基因DNA的提取为寻找高效提取兔盲肠肠道微生物宏基因组DNA,本研究从兔盲肠肠道内收集菌体之后。分别采用三种不同的基因组提取方法。用这三种方法均能提取获得宏基因组DNA。通过测定所获得DNA的OD_260/280,以及进行分析限制性酶酶切分析,发现:PVPP-电洗脱方法获得的基因组DNA的纯度最高,基因组DNA含量较大,同时可以较好的被限制性内切酶酶切消化:基因组提取试剂盒方法虽然操作最为简单且提取到的DNA纯度较高,但是提取基因组的量很低,且酶切效率不高;方法酚氯仿方法提取基因组DNA的量最大,但是DNA纯度最差,且用限制性内切酶无法进行酶切消化。提取结果比较表明,PVPP-电洗脱方法所得到的兔盲肠宏基因组DNA含量较高,纯度也高,而且能很好的被限制性内切酶消化,可以满足后续建库的要求。二、兔盲肠内微生物宏基因组DNA文库的构建从采集的兔盲肠内提取微生物宏基因组DNA,然后利用限制性内切酶Sau 3AI进行部分酶切消化,回收大小为2.0-4.5kb左右的DNA片段。回收的片段DNA与预先用Bam HI酶切、并经去磷酸化处理的质粒pUC118载体连接,转化到大肠杆菌感受态细胞内,构建宏基因组文库。本次的研究中,成功构建了一个约含有9000个重组克隆的兔盲肠内容物宏基因组DNA文库,其插入片段的大小主要为1.5-4.5kb。这为后续新型基因的筛选利用提供了材料,同时为探索兔盲肠微生物多态性研究奠定了基础。三、β-葡萄糖苷酶基因的分离研究本研究利用β-葡萄糖苷酶活性检测平板,从兔盲肠宏基因组文库中分离得到1个β-葡萄糖苷酶基因,编号为ngul007。该基因的开放阅读框（ORF）全长为282bp,GC含量为60.3%,编码93个氨基酸。该基因编码的蛋白质的预计分子量（MW）为10545.90Da,等电点（pI）为5.30。是一种亲水性蛋白质。推导的蛋白序列中没有信号肽序列存在,但有一个跨膜结构域,位于76-81残基之间。通过NCBI在线Blast比对分析表明:该β-葡萄糖苷酶基因ngul007与现有数据库中的β-葡萄糖苷酶基因之间在核苷酸或者氨基酸水平上无同源性,因而被推测是新型的β-葡萄糖苷酶编码基因。四、β-葡萄糖苷酶酶学性质分析本研究以大肠杆菌为表达宿主菌,以同一批发酵液测定不同条件下酶活力大小,初步研究该β-葡萄糖苷酶基因编码产物的酶学性质。测定结果显示:该酶反应最适温度为50℃左右,最适pH为10.0。该酶在中性和碱性环境中具有比较高的酶活力,同时具有比较好的稳定性;在高温时虽然能具有较高的反应酶活力,但是稳定性却很差,且随着温度的升高稳定性也越来越差。不同金属离子及表面活性物对该酶酶活力具有不同的影响。Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺对该酶有较强的促进作用;Ca²⁺、Cu²⁺对酶活力没有影响;而Na⁺、K⁺、Fe³⁺、EDTA、脲对该酶有较强的抑制作用,甚至使酶完全失去活性。该酶的底物特异性不强,它可以作用于不同底物的β-葡萄糖苷键,且酶活力大小不同。对于乳糖和麦芽糖表现较高的酶活力,几丁质次之。对于滤纸、七叶苷及粉末纤维素均表现一定的酶活力。上述研究结果表明,对于通过宏基因组筛选分离得到的β-葡萄糖苷酶基因nglu007为一个新的β-葡萄糖苷酶基因,对于它的研究有利于对β-葡萄糖苷酶及纤维素酶的研究利用。且通过酶学性质研究发现,该酶可以很好的适应碱性环境,可用于碱性酶制剂的生产利用,对于它进一步的高效表达生产开发具有十分重要的意义和价值。