基因编辑技术，兴起于上世纪80年代，开启了人们对基因功能研究的热潮。CRISPR-Cas9作为近年来新兴的基因编辑技术，具有载体构建简单、基因敲除率高等优势。绒山羊作为我国独特的生物资源，具有产绒量高，绒质好等诸多优点，其羊绒更具有“生物黄金”的美誉。因此进行高产绒量的品种选育具有极高的意义和巨大的市场潜力。而毛发生长涉及到一个及其复杂的基因调控机制。以往研究表明，Noggin基因的过表达和FGF5基因的敲除都会促进毛发生长。本实验主要针对毛发生长正调控基因Noggin和负调控基因FGF5，利用CRISPR-Cas9技术和基因随机整合技术，研究CRISPR-Cas9的敲除效率及FGF5敲除Noggin基因过表达同时作用后，在转录水平上检测其对毛发生长相关基因的mRNA表达量，从而预测FGF5、Noggin双基因编辑对毛发生长的影响。　　1、小鼠胎儿成纤维细胞转染条件优化　　本实验利用电转染法，以pCMV-DsRed质粒质量梯度和电转染电压和脉冲时间组合参数梯度，研究了转染小鼠胎儿成纤维细胞的最佳转染条件，结果显示电转染质粒总质量、电压、脉冲时间的最佳组合为10μg/160V/5mM。　　2、gRNA-FGF5、Noggin随机整合载体pK14-Noggin和Noggin定点整合载体pKI-Noggin的构建　　本研究成功的构建了针对小鼠FGF5基因的向导RNA（gRNA-FGF5），结果显示其可成功引导Cas9蛋白到目的靶位点进行双链DNA切割。本实验同时成功构建了两个Noggin基因皮肤特异性表达载体。一个为Noggin随机整合载体pK14-Noggin，用于Noggin过表达研究。另一个为Noggin定点整合载体pKI-Noggin，用于今后CRISPR/cas9，gRNA-FGF5介导Noggin定点整合模式动物构建。　　3、FGF5基因敲除效率和Noggin基因随机整合检测　　我们对以上实验构建的gRNA-FGF5和Noggin基因皮肤特异性随机整合载体pK14-Noggin进行效率检测。首先，我们通过电转染的方法将Cas9质粒与gRNA-FGF5共同转染小鼠胎儿成纤维细胞，提取细胞总基因组作为模板，用FGF5靶位点检测引物进行PCR反应，并利用Surveyor突变检测试剂盒检测，结果证明实验设计的gRNA-FGF5可以高效的引导Cas9蛋白对目标靶点的切割。本研究还运用T-A克隆的方法将PCR产物连入pMD19-T载体，随机挑取20个阳性重组子委托北京华大基因公司进行测序。结果显示:随机挑取的20个重组子中有11个在靶位点具有不同程度的碱基缺失与插入，由此结论获得突变率约为55％。　　其次，我们将pK14-Noggin质粒电转染小鼠胎儿成纤维细胞，48h后，提取细胞总蛋白，利用western blot检测，结果显示Noggin蛋白相对表达量是相同来源及代次野生型对照细胞的1.41倍。　　4、FGF5敲除Noggin过表达对毛发生长相关因子的影响　　本实验将Cas9、gRNA-FGF5转染MEF细胞得到EG1;pK14-Noggin转染小鼠MEF细胞得到EG2; Cas9、gRNA-FGF5、pK14-Noggin共转染小鼠MEF细胞得到EG3，并以未转基因的小鼠MEF细胞CG作为对照。转染48h后，以4种细胞的总eDNA作为模板，利用qPCR的方法，在mRNA水平上检测Tβ4、β-catenin、vegf三个基因的mRNA相对表达量，结果显示:FGF5敲除的细胞β-catenin、Vegf、Tβ4mRNA相对表达量分别是空白对照的2.82/1.37/1.47倍。noggin随机整合的细胞β-catenin、Vegf、Tβ4 mRNA相对表达量分别是空白对照的2.44/1.32/1.37倍。FGF5敲除、noggin随机整合的细胞β-catenin、Vegf、Tβ4 mRNA相对表达量分别是空白对照的3.22/1.69/1.71倍。