目的： 1．建立大鼠骨髓(bone marrow)间充质干细胞(mesenchymal ste mcells,MSCs)的体外培养体系，为MSCs深入研究提供实验模型； 2．观察大鼠MSCs在成骨培养条件下的生物学特征及体外成骨活性，为其作为骨组织工程种子细胞提供初步的实验依据； 3．构建大鼠MSCs与骨支架材料复合物，观察大鼠MSCs在同系大鼠体内异位成骨能力，初步探讨其可能机制，为MSCs作为骨组织工程种子细胞提供应用基础实验研究。 方法： 1．大鼠MSCs分离及体外培养：取8w龄大鼠，体重为100g～120g，引颈处死后，无菌条件下取出股骨和胫骨，基础培养基冲出骨髓，利用密度为1.077×103g/L的淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓中单个核细胞，以含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素的LG-DMEM培养基进行原代培养(37℃，5％CO2)，3d后首次换液，待细胞长至10～14d达到70％～80％融合后传代，倒置相差显微镜下对其形态学特征进行观察，取传至第3代的MSCs应用流式细胞仪检测其表面分子CD44、CD45的表达情况； 2．取第三代大鼠MSCs，按照5×107/L的细胞密度制备细胞爬片，培养3天后除去培养液，加入含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10-8mol/L的地塞米松，10mmol/L的β-甘油磷酸钠，50mg/L的抗坏血酸的LG-DMEM培养液在体外进行成骨诱导分化，倒置显微镜下观察诱导前后形态学变化。诱导14天，钙钴法检测碱性磷酸酶表达；诱导21天，Von-Kossa染色检测成骨情况，免疫荧光法检测I型胶原表达； 3．取第三代大鼠MSCs消化、离心，制成浓度为106细胞/mL细胞悬液，与骨支架材料多孔β-磷酸三钙(β tricalcinm phosphate，β-TCP)立方块(5mm×5mm×5mm，200～400μm孔径， 95％多孔性)37℃共孵育2h，获得MSCs/β-TCP复合物共32枚，随机分成两组，每组16枚，分别以不同培养基培养，第1组为成骨诱导组，采用含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素，10-8mol/L的地塞米松，10mmol/L的β-甘油磷酸钠，50mg/L的抗坏血酸的LG-DMEM培养液进行培养；第2组为未诱导组，采用含10％FBS，100mg/L青霉素，100mg/L链霉素的LG-DMEM培养液培养；另设第3组对照组，为未与任何细胞复合的β-TCP16枚，加入含10％FBS，100mg/L青霉素100mg/L链霉素的LG-DMEM培养液。体外复合培养7d后进行体内实验，随机选取12只SD大鼠(雄性，体重150g～200g)，1％戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，于背侧皮下对称植入同组复合物4枚，每组四只大鼠，孤养，于6w和14w每组各取出两只处死后取出复合物多聚甲醛固定，EDTA脱钙，乙醇系列脱水，石蜡包埋后切片，HE染色光镜下观察细胞形态学变化，免疫组织化学染色检测I型胶原表达； 4．统计学分析：同一时间点不同组间比较采用单因素方差分析，同一组不同时间点间比较采用t检验。 结果： 1．原代培养细胞悬浮，以折光性强的圆形细胞为主，3天首次换液可见贴壁细胞出现，以小角形多见，其间杂有少量有核淋巴细胞，均分散生长，出现克隆球样小团簇生长；7～10天后,贴壁细胞明显增多，出现成纤维样细胞外观，呈长梭形；14天左右细胞可达70％～80％的融合，细胞排列具有明显的方向性，呈漩涡状，传3代后流式细胞仪检测其表面分子CD44表达阳性，CD45为阴性。 2．利用条件培养基体外诱导MSCs向成骨细胞分化观察到细胞体积减小，立体感增强，大多数细胞呈多角形或立方形，细胞突起互相连结，重叠生长逐渐堆积形成结节状；诱导第14d钙钴法碱性磷酸酶染色，细胞呈多角形，细胞界限清楚，胞浆呈浅灰色，出现棕黑色颗粒，部分融合成块状，呈强阳性反应；诱导第21d出现致密圆形的矿化结节，以圆形多见，经销酸银染色后矿化结节呈现黑色；诱导第21d免疫荧光检测Ⅰ型胶原表达阳性。 3．体内实验HE染色观察成骨诱导组细胞沿β-TCP空隙生长，排列规则，进行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色，分别测量Ⅰ型胶原积分光密度(integrated optical density，IOD)。经统计学分析，成骨诱导组6w与未诱导组相比Ⅰ型胶原IOD增高(P=0.034<0.05)、与对照组相比I型胶原IOD增高(P=0.011<0.05)；成骨诱导组14w与对照组比较Ⅰ型胶原IOD增高(P=0.026<0.05)；成骨诱导组6 w与14w比较14w Ⅰ型胶原IOD增高(P=0.028<0.05)；未诱导组6w与14w比较14w Ⅰ型胶原IOD增高(P=0.009<0.05)。 结论： 1．密度梯度离心法和贴壁法成功进行了大鼠MSCs的分离、培养及扩增，获得无造血干细胞污染的MSCs。 2．MSCs在体外成骨培养条件下，能表现出成骨样细胞的某些生物学特征，这为进一步研究MSCs作为骨组织工程种子细胞提供初步的实验依据。 3．经成骨诱导培养后的MSCs复合骨支架材料多孔β-T CP在同种异体内具有异位成骨能力，为MSCs作为骨组织工程种子细胞提供进一步的实验依据。