研究背景与目的:自从1996年脊柱外科领域权威杂志《SPINE》上发表关于腰痛作为人类世纪难题的文章,腰痛也越来越引起大家的重视,椎间盘变性引起的慢性背痛和颈肩痛是威胁人类健康的严重问题,目前没有有效的治疗方法。慢性腰背部疼痛是造成劳动力丧失的常见原因。对于严重的椎间盘退行性病变的患者,目前主要采用手术治疗为主的治疗方法:腰椎间融合,人工椎间盘置换术,微创髓核摘除术等。手术治疗可以一定程度的减轻患者的症状,但手术合并很多并发症,例如相邻节段椎间盘退变加重,椎间隙感染等,这常常需要进一步的外科手术。虽然手术可以减轻临床症状,但既不阻止变性的进展,也不能恢复椎间盘(Intervertebral disc,IVD)的天然功能状态。基于上述外科干扰的情况和限制,因此,在探寻椎间盘退变机制及寻求无创治疗的研究一直并未停止。椎间盘退变是复杂的多因素过程,虽然做了长期大量的研究工作,其确切机制并未完全了解。当前研究以炎症通路为主,大量研究表明退变的椎间盘细胞能产生炎性介质,包括:TNF-α,IL-1α/β,IL-6,IL-10和IFN-γ等等。这些因子导致炎症级联反应促进基质降解,趋化因子的产生和细胞表型的改变。由此导致了基质成分分解和合成之间出现严重不平衡最终导致椎间盘退变。炎症因子对椎间盘细胞的作用并不存在疾病特异性,具有的局限性,转化效益差等椎间盘是人体中最大的无血管组织。椎间盘由内层的富含水和胶原的髓核和外层富含纤维的纤维环两部分组成。椎间盘退变的特征在于细胞外基质中主要成分II型胶原和蛋白聚糖的含量明显较少,直接导致与水结合能力的降低,椎间盘含水量减少,髓核细胞数量减少,被成纤维细胞样表型的细胞的替换。椎间盘作为特殊的软骨组织,其退变过程可能与骨化相关基因有着密切的联系。课题组在前期研究中已经发现有报道关于骨化相关基因RUNX2能够引起椎间盘退变。TWIST作为骨化相关基因的重要一员,参与早期抑制RUNX2调控成骨细胞化。基于上述内容,我们推测在椎间盘退变中,TWIST基因也起着至关重要的作用。第一部分:TWIST基因在髓核组织中的表达目的:研究TWIST基因在人髓核组织中的表达情况。方法:(1)利用GEO数据库,生物信息学筛选椎间盘退变中骨化相关基因。(2)收集2016年3月-2017年6月因腰突症于我院行腰椎手术的患者的椎间盘标本,根据磁共振Pfirrmann分级系统,I-II级为轻度退变对照组,III-V级为重度退变退变组。共采集患者标本32例,其中对照组12例,退变组20例。对收集的椎间盘组织进行鉴定。(3)对椎间盘组织细胞针对筛选的骨化相关基因进行免疫组化。(4)椎间盘组织RNA提取及验证,通过实时定量PCR的检测方式明确骨化基因在椎间盘退变中的表达。结果:(1)骨化相关IBSP、ENPP、OPN等在椎间盘退变网路中存在,提示骨化相关基因在椎间盘退变中可能具有重要地位。(2)经组织学鉴定,椎间盘退变程度与Pfirrmann分级一致,分组合理。(3)组化显示成骨相关基因均呈不同程度的上调,而骨化抑制相关基因中TWIST1及TWIST2能够随着退变逐渐下调。(4)通过椎间盘髓核组织的RNA检测结果显示TWIST1及TWIST2确实如组化所示在退变中出现明显下调。结论:我们利用GEO数据库、椎间盘标本免疫组化、椎间盘组织RNA提取与验证对退变椎间盘中骨化基因进行检测,明确骨化相关基因在退变椎间盘中异常表达,TWIST1及TWIST2在退变椎间盘中明显下调。第二部分:TWIST基因在人髓核细胞退变过程中的作用目的:研究TWIST基因在人髓核细胞中的表达情况。方法:(1)收集2016年5月-2017年7月因脊柱外伤或脊柱侧弯等患者的Pfirrmann分级I-II级的椎间盘组织,进行原代人髓核细胞培养。(2)通过TWIST1及2基因全长PCR将TWIST表达CDS区纯化、克隆入表达载体,并于髓核细胞中利用转染试剂进行TWIST1及2基因的过表达,构建TWIST的过表达及干扰载体。(3)利用炎症因子IL-1β与TNF-α进行体外髓核细胞的炎性刺激,构建体外髓核细胞退变模型。(4)通过转染TWIST1/TWIST2过表达及干扰载体于髓核细胞中,培养24h后通过Real-time PCR检测处理后髓核细胞ECM降解相关MMP、ADAMTS的表达情况明确退变情况。(5)同上处理后通过Western Blot检测处理后髓核细胞ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。结果:(1)通过原代培养髓核组织,成功建立体外髓核细胞系6株。(2)检测细胞TWIST1及2的表达发现确实出现上调,提示过表达及干扰载体构建成功。(3)通过检测发现刺激后髓核细胞CHSY、ACAN、II型胶原等基质相关基因表达减少,基质降解相关MMP、ADAMTS表达显著增加,体外模型构建成功。(4)过表达TWIST1及2基因,髓核细胞CHSY、ACAN、II型胶原等基质相关基因表达较对照组显著增加,基质降解相关MMP、ADAMTS表达显著减少。结论:我们通过髓核细胞原代培养、构建TWIST过表达载体、构建体外退变模型、转染过表达载体等方法,明确TWIST基因在体外确实具有抑制椎间盘退变,保护椎间盘的作用。第三部分:TWIST基因保护椎间盘退变的机制研究目的:研究TWIST基因保护椎间盘退变的机制研究。方法:(1)构建RUNX2过表达及干扰载体。(2)于人髓核细胞中过表达RUNX2基因并检测ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。(3)利用共转染的方式将TWIST与RUNX2于退变髓核中共表达,检测ECM相关CHSY、MMP、ADAMTS等酶的表达情况。(4)构建RUNX2启动子双荧光报告载体,检测TWIST过表达后RUNX2启动子的活性情况。结果:(1)成功构建RUNX2过表达及干扰载体。(2)RUNX2过表达后髓核基质合成相关ACAN、COL2A1等基因出现显著下调,提示其具有促进退变发生的作用。(3)共转染TWIST与RUNX2于退变髓核后,RUNX2基因引起的促退变效应出现一定程度上的缓解。(4)利用双荧光素酶报告基因检测过表达TWIST后对RUNX2下游功能的影响,发现TWIST能够显著抑制RUNX2的活性。结论:我们通过构建RUNX2过表达及干扰载体、共转染TWIST与RUNX2、双荧光素酶报告基因检测等方法,进一步明确TWIST制椎间盘退变,保护椎间盘的作用主要是通过抑制RUNX2的活性来实现的。