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β-甘露聚糖酶（endo-β-1,4-D-mannanase, EC3.2.1.78）广泛存在于各种生物体尤其是微生物中，能从甘露聚糖的主链内部随机水解β-1,4-D-甘露糖苷键产生低聚甘露糖。它在食品、制药、饲料、造纸、纺织和生物能源等领域彰显广阔的应用前景。采用同源建模和分子对接模拟等方法预测宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）GH5家族β-甘露聚糖酶（AuMan5A）与甘露二糖对接复合物的空间结构，使用PyMol软件统计到38个距离甘露二糖8以内的氨基酸位点。通过多序列比对排除21个保守氨基酸位点，参考氨基酸性质及其所处空间位置从AuMan5A的17个非保守氨基酸中选取5个芳香族氨基酸Trp54、Tyr111、Tyr115、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸，将它们分别替换为性质相似的或在其它β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸，形成一系列拟突变酶。采用分子力学泊松-波尔兹曼表面积（MM-PBSA）法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能，其中拟突变酶AuMan5AY111F和AuMan5AY115F与配体分子的结合自由能分别为-56.8kcal/mol和-75.0kcal/mol，低于AuMan5A及其它拟突变酶。选择结合自由能升高至-20.8kcal/mol的拟突变酶AuMan5AY243A作为阴性对照。基于理性设计结果采用大引物PCR技术分别扩增突变酶基因Y111F、Y115F和Y243A，并构建重组表达质粒pPIC9K-Y111F、pPIC9K-Y115F和pPIC9K-Y243A。将它们和pPIC9K-Auman5A用SacⅠ线性化后电击转化至毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达后测得重组原酶WT、重组突变酶Y111F和Y115F对角豆胶的最高酶活性分别可达44.8U/mL、53.0U/mL和50.4U/mL。重组突变酶Y243A则未表现出任何酶活性，说明Tyr243对AuMan5A活性的维持至关重要。经(NH4)2SO4盐析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、超滤及SephadexG-75凝胶过滤层析纯化，WT、Y111F和Y115F对角豆胶的比酶活分别为209.5U/mg、293.0U/mg、284.1U/mg，纯化倍数分别为1.9、2.2、1.8，回收率分别为48.4％、52.6％、56.8％。SDS-PAGE电泳分析可知，纯化后的重组酶为单一条带，表观分子量约为49.5kDa。WT、Y111F和Y115F对瓜尔豆胶的Km值分别为(4.49±0.07) mg/mL、(2.95±0.22)mg/mL、(2.39±0.33) mg/mL。与WT相比，Y111F和Y115F对瓜尔豆胶的Km值分别降低了34.3%和46.8%，催化效率分别增加了0.5倍和0.7倍，其它性质几乎不变。结构分析表明突变酶Y111F和Y115F通过降低复杂底物结合的空间位阻来提高其亲和力。采用大引物PCR技术构建双突变酶基因Y111F/Y115F，并成功实现其在毕赤酵母GS115中的异源表达，测得重组双突变酶Y111F/Y115F的活性为45.7U/mL。用同样的方法纯化该酶，最终其对角豆胶的比酶活为327.5U/mg，纯化倍数为2.4，回收率为58.5％。该酶对瓜尔豆胶的Km值为(2.89±0.24) mg/mL，与WT相比，其Km值降低了35.6%，催化效率提高了1.5倍，而其它酶学性质几乎不变。运用本研究获得的重组酶水解瓜尔豆胶，初步优化的水解条件为：瓜尔豆胶（水溶液）浓度20g/L，Y111F/Y115F添加量60U/g瓜尔豆胶，50℃酶解6h，在此条件下瓜尔豆胶的水解率可达18.7%。本论文的理性设计并结合定点突变技术用于提高宇佐美曲霉β-甘露聚糖酶底物亲和力的实验方案和结果，迄今为止未见有国内外文献报道。