研究背景与目的胰腺癌是目前恶性程度最高的人类肿瘤之一,是美国第四大癌症死亡因素和欧洲第五大癌症死亡因素,经过几十年的努力,其五年生存率也只有5%,是所有肿瘤中最低的。大部分早期胰腺癌病人没有明显的症状,一经诊断即为晚期浸润或转移癌。此外,只有15%的病人可以手术切除肿瘤,而其中又有16%的含有不能完全切除的微小肿瘤。术后85%病人在1-2年内复发和转移。因此,急需开发新的治疗手段解决此难题。基于复制选择性溶瘤病毒的病毒免疫基因治疗是极具前景的肿瘤治疗方法。复制选择性溶肿瘤病毒具有特异地靶向、裂解肿瘤细胞并引起抗肿瘤免疫反应的特性,同时也是非常好的治疗基因的传递载体。第一代的复制选择性溶肿瘤人5型腺病毒ONYX-015(dl1520)曾经被测试治疗人胰腺癌,临床试验显示其有很好的安全性,但是单独使用没有很好的效果,即便与吉西他滨联结合应用也只有10%患者(2/21)显示有客观反应。因此需要寻找新的策略来进一步提高第一代溶肿瘤病毒的疗效。白介素12(interleukin,IL-12)是最具抗肿瘤潜能的细胞因子之一,对形成肿瘤微环境的不同的免疫细胞具有多种效应,但是由于引起严重的毒副反应而未被用于临床。因此,急需开发将IL-12传递到肿瘤微环境,达到持续、局部和低毒的抗肿瘤作用的方法。表达IL-12的复制缺陷和复制选择性腺病毒对各种肿瘤的治疗有非常好的效果。其它表达IL-12的溶肿瘤病毒也显示了很好的抗肿瘤效果。但是,不管是系统还是局部给药,大部分溶肿瘤病毒表达过高的IL-12进入外周血或者诱导产生大量的系统性干扰素γ(IFN-γ),引起严重的毒副作用。溶肿瘤病毒的抗肿瘤效果依赖于病毒、肿瘤细胞和机体免疫反应的相互作用。第一代溶肿瘤腺病毒因删除E1B55K和E3区基因导致病毒严重缺陷。基于对腺病毒E1ACR2,E1B19K和E3gp19K基因功能的深入研究,本研究构建了三个基因删除(triple deletion,TD)并表达非分泌 IL-12(non-secretoryIL-12,nsIL-12)的新型溶肿瘤腺病毒Ad-TD-nsIL-12。由于腺病毒能在叙利亚仓鼠组织里很好的复制,同时又有很多肿瘤细胞系可用于抗肿瘤研究,且叙利亚仓鼠胰腺癌与人类患者临床反应高度相似,因此,本课题在具有完整免疫系统的叙利亚仓鼠体内进行了 Ad-TD-nsIL-12的抗肿瘤效果和安全性研究。第一部分新型溶肿瘤腺病毒的构建与鉴定1目的构建并鉴定具有肿瘤靶向性和表达免疫治疗基因的新型溶肿瘤腺病毒。2方法2.1重组穿梭载体的构建高保真酶克隆目的基因,插入含有左右同源臂的穿梭质粒载体中,构建重组穿梭载体。2.2电击转化法同源重组腺病毒载体将构建好的重组穿梭质粒线性化,通过电击转化与腺病毒载体在BJ5183细菌中进行同源重组。2.3新型溶肿瘤病毒的生产和鉴定将构建成功的腺病毒载体线性化,转染293细胞,生成有感染能力的病毒。批量生产并纯化病毒。纯化后的病毒进行全基因组测序,ELISA检测细胞感染病毒后IL-12的表达水平。2.4 IL-12对叙利亚仓鼠免疫细胞的刺激作用分离人、叙利亚仓鼠和小鼠的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在PHA刺激后,加入IL-12标准品和新型溶肿瘤病毒表达的IL-12,检测单个核细胞增殖情况。分离叙利亚仓鼠的脾细胞,在PHA刺激后,加入人IL-12,检测叙利亚仓鼠脾细胞表达IFN-y和TNF-α的表达。3结果3.1重组穿梭载体的构建测序分析证实成功构建了 pssIL-12、pssnsIL-12和pssLUC重组穿梭载体。3.2电击转化法同源重组腺病毒载体酶切鉴定和测序分析证实,成功构建了新型溶肿瘤腺病毒载体Ad-TD-IL-12、Ad-TD-nsIL-12 和 Ad-TD-LUC.3.3新型溶肿瘤病毒的生产和鉴定成功生产出高滴度的腺病毒,基因组测序表明病毒基因序列完全正确,ELISA 结果显示 Ad-TD-IL-12 和 Ad-TD-nsIL-12 均表达 IL-12。3.4 IL-12对外周血单个核细胞的增殖影响Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12表达的人IL-12刺激人和叙利亚仓鼠的PBMC的增殖,而不能刺激小鼠的PBMC的增殖。人IL-12能刺激叙利亚仓鼠脾细胞表达IFN--γ和TNF-α。4结论成功构建和生产了表达治疗基因的新型靶向溶肿瘤腺病毒,并发现人IL-12对叙利亚仓鼠免疫细胞有功能。第二部分新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌的治疗作用1目的检测新型溶肿瘤腺病毒对胰腺癌的治疗作用。2方法2.1新型溶肿瘤腺病毒在体外对肿瘤细胞的杀伤作用的检测细胞杀伤实验(MTS法)检测dl1520和新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌和肾癌细胞系的杀伤作用。2.2溶肿瘤腺病毒在正常细胞和肿瘤细胞中的复制能力的检测通过复制实验检测dl1520和新型溶肿瘤腺病毒在正常细胞和肿瘤细胞中的复制能力。2.3新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌皮下肿瘤模型的治疗作用构建叙利亚仓鼠胰腺癌.HPD1NR皮下肿瘤模型,当肿瘤体积为80 mm3和160 mm3时,检测dl520和Ad-TD-LUC的治疗作用;当肿瘤体积达到3l0mm3时,检测 Ad-TD-LUC,Ad-TD-IL-12 和 Ad-TD-nsIL-12 的治疗作用。2.4新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌原位肿瘤模型的治疗作用构建叙利亚仓鼠胰腺癌Hap-T1原位肿瘤模型,检测不同剂量下Ad-TD-LUC,Ad-TD-IL-12 和 Ad-TD-nsIL-12 的治疗作用。2.5新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散肿瘤模型的治疗作用构建叙利亚仓鼠胰腺癌腹腔播散肿瘤模型,检测不同剂量下Ad-TD-LUC,Ad-TD-IL-12 和 Ad-TD-nsIL-12 的治疗作用。3结果3.1新型溶肿瘤腺病毒在体外对肿瘤细胞的杀伤作用的检测。细胞杀伤实验发现新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌和肾癌细胞系的杀伤作用比dl1520更强。3.2溶肿瘤腺病毒在正常细胞和肿瘤细胞中的复制能力的检测病毒复制实验表明新型溶肿瘤腺病毒比dl1520在正常细胞中复制能力弱,在肿瘤细胞中比dl1520强。3.3新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌皮下肿瘤模型的治疗作用在叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型中,当肿瘤体积为80 mm3和160 mm3时,ddl520和Ad-TD-LUC都对肿瘤具有较好的治疗作用;当肿瘤体积为160 mm3时,dl520无明显疗效,但Ad-TD-LUC能显著抑制肿瘤生长;当肿瘤体积达到3l0mm3时,Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12能完全治愈肿瘤,而Ad-TD-LUC无明显肿瘤抑制作用。3.4新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌原位肿瘤模型的治疗作用在低剂量下,Ad-TD-nsIL-12能显著提高荷胰腺癌Hap-Tl原位肿瘤的叙利亚仓鼠生存率,Ad-TD-LUC无明显治疗效果,而Ad-TD-IL-12导致全部实验动物比对照组死亡更早。在提高Ad-TD-LUC和Ad-TD-nsIL-12的剂量和降低Ad-TD-IL-12的剂量后,Ad-TD-nsIL-12能显著提高叙利亚仓鼠生存率,Ad-TD-LUC和Ad-TD-IL-12无明显治疗效果,低剂量Ad-TD-IL-12仍导致部分实验动物比对照组死亡更早。3.5新型溶肿瘤腺病毒对叙利亚仓鼠胰腺癌腹腔播散肿瘤模型的治疗作用在叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散肿瘤模型中,Ad-TD-LUC能显著提高荷叙利亚仓鼠生存率,Ad-TD-nsIL-12能治愈所有荷瘤动物,而高中低三个剂量的Ad-TD-IL-12都不能显著提高荷叙利亚仓鼠生存率。在给予一次大剂量的Ad-TD-nsIL-12也能治愈所有荷瘤动物。4结论Ad-TD-nsIL-12在不同的胰腺癌肿瘤模型中具有很强的抗肿瘤作用和安全性。第三部分新型溶肿瘤腺病毒的安全性和抗肿瘤机制研究1目的检测Ad-TD-nsIL-12的安全性和抗肿瘤作用机制。2方法2.1 Ad-TD-nsIL-12对肝脏功能的影响采用生化分析仪检测叙利亚仓鼠胰腺癌腹腔播散模型在腹腔注射溶肿瘤腺病毒后在第1,3,5天外周血中反映肝功能的酶水平和IL-12的表达情况。HE染色检测叙利亚仓鼠胰腺癌原位模型在腹腔注射溶肿瘤腺病毒后在第1和3天肝脏细胞损伤情况。2.2新型溶肿瘤腺病毒引起特异抗肿瘤免疫和长期免疫保护的研究将胰腺癌皮下肿瘤模型疗效实验中Ad-TD-IL-12或者Ad-TD-nsIL-12治疗组肿瘤全部被清除的实验动物重新接种原皮下接种的胰腺癌肿瘤细胞HPD1NR和肾癌细胞Hak,其中一组在接种HPD1NR的前一天腹腔注射CD3删除抗体。在叙利亚仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散模型治疗40天后,在腹腔重新接种SHPC6。2.3介导Ad-TD-nsIL-12抗肿瘤作用T细胞群的研究构建叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型,当肿瘤体积为300 mm3时,腹腔内注射对照抗体,CD3和CD4删除抗体,第二天开始肿瘤内注射Ad-TD-nsIL-12进行治疗,观察肿瘤生长情况。2.4 Ad-TD-nsIL-12对机体免疫系统和肿瘤微环境的影响构建叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPD1NR皮下肿瘤模型,当肿瘤体积为300 mm3时,肿瘤内注射一次新型溶肿瘤腺病毒进行治疗,在第3,7,21天分别取动物的脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织,分别进行流式细胞术、实时荧光定量PCR和免疫组化检测脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织的免疫细胞群和细胞因子的变化。2.5 Ad-TD-nsIL-12在叙利亚仓鼠胰腺癌原位模型中的抗肿瘤和安全性研究构建叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌Hap-T1原位肿瘤模型,腹腔内注射新型溶肿瘤腺病毒进行治疗,在不同时间点分别取动物的肝脏、外周血和肿瘤组织,分别进行ELISA、实时荧光定量PCR和免疫组化检测IL-12表达、免疫细胞群和病毒蛋白的变化。2.6 nsIL-12在其他溶肿瘤病毒载体中的抗肿瘤作用将nsIL-12基因插入到溶肿瘤痘苗病毒和腺病毒11载体中,构建了 VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12。构建叙利亚仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散肿瘤模型,检测不同剂量下VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12的治疗作用。3结果3.1 Ad-TD-nsIL-12对肝脏功能的影响生化分析显示Ad-TD-nsIL-12和对照病毒Ad-TD-LUC不引起明显的肝功能的酶AST、ALT和ALP水平的升高,而Ad-TD-IL-12引起肝功能的酶水平显著增高;在外周血中Ad-TD-IL-12高表达IL-12,,而Ad-TD-nsIL-12持续表达低水平的IL-12。3.2新型溶肿瘤腺病毒引起特异抗肿瘤免疫和长期免疫保护的研究当胰腺癌皮下肿瘤模型疗效实验中的肿瘤全部被清除的实验动物重新接种原皮下接种的肿瘤细胞HPD1NR时,不能形成肿瘤;接种的肾癌细胞Hak肿瘤持续生长;在接种HPD1NR的前一天腹腔注射CD3删除抗体的动物的肿瘤持续生长。荷胰腺癌腹腔播散模型的叙利亚仓鼠经治疗40天后重新接种SHPC6,90%实验动物未复发。3.3介导Ad-TD-nsIL-12抗肿瘤作用的T细胞群的研究叙利亚仓鼠仓鼠胰腺癌HPDINR皮下肿瘤模型,在Ad-TD-nsIL-12治疗的前一天腹腔内注射对照抗体,CD3和CD4删除抗体。CD4删除抗体和对照抗体不影响Ad-TD-nsIL-12的抗肿瘤效果,而CD3删除抗体能抑制Ad-TD-nsIL-12抗肿瘤作用。3.4 Ad-TD-nsIL-12对机体免疫系统和肿瘤微环境的影响在肿瘤组织中,Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12对肿瘤浸润T淋巴细胞有相同的影响。在脾脏、引流淋巴结和肿瘤组织中,Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12引起促进抗肿瘤作用的相关细胞因子表达增高。Ad-TD-nsIL-12仅能在第7天使引流淋巴结的CD4+和CD3+CD4-T细胞增加,不影响脾脏内T细胞的增殖,而Ad-TD-IL-12除了能在第7天使引流淋巴结的CD3+CD4-T细胞增加外,在3,7,21天还影响脾脏内CD3+CD4-T细胞的增殖。3.5 Ad-TD-nsIL-12在叙利亚仓鼠胰腺癌原位模型中的抗肿瘤和安全性研究肿瘤生长曲线显示,Ad-TD-nsIL-12能显著抑制肿瘤生长。实时荧光定量PCR结果显示溶肿瘤病毒主要靶向肿瘤细胞。免疫组化显示病毒在肿瘤组织内复制,并且导致肿瘤浸润淋巴细胞增加。HE染色显示Ad-TD-nsIL-12对肝脏无明显毒性。3.6非分泌IL-12在其他溶肿瘤病毒载体中的抗肿瘤作用叙利亚仓鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散肿瘤模型,在经过VV-nsIL-12、Ad11-nsIL-12和相应对照病毒的治疗后。VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12均能显著提高叙利亚仓鼠的生存率。4结论4.1 Ad-TD-nsIL-12的安全性是因为能持续、局部和低表达IL-12;仅影响局部免疫器官,改变肿瘤微环境;4.2 Ad-TD-nsIL-12治疗能引起特异的肿瘤免疫反应和长期的免疫保护,起主要作用的是CD3+CD4-(CD8+)T细胞。