脑瘫(cerebral palsy, CP),又名小儿脑瘫、脑性瘫痪,是继脊髓灰质炎被控制后,近代最常见的儿童致残性疾病。CP临床主要症状包括运动障碍、姿势障碍、智力障碍、听觉障碍、语言障碍、口面功能障碍、生长发育障碍、行为情绪障碍及癫痫等,它给儿童、家庭、社会都带来了经济上、精神上、心理上的巨大负担。因此,如何对脑瘫儿童进行康复,使他们早日获得生活自理的能力,是医务工作者的使命和患儿家长面临的巨大挑战。目的通过动物实验,观察针灸对幼鼠CP模型行为学及学习记忆能力、脑组织病理学形态、脑组织细胞超微结构以及脑组织单胺类神经递质与氨基酸含量的影响,为针灸早期介入小儿脑瘫治疗提供理论依据,并为针灸治疗小儿脑瘫提供新的思路和方法。方法一、实验材料及实验条件动物：选用7d龄新生SD幼鼠,由广州中医药大学实验动物中心提供,SPF级,实验动物质量合格证明编号：0043108；许可证号：SCXK(粤)2008-0020。选取幼鼠8窝102只,要求7日龄时体重>12g,雌雄不限。实验室：广州中医药大学动物实验中心中医实验动物实验室,SPF级：温度22℃～26℃,相对湿度60～80%,定时通风换气,实验动物设施使用证明,No.0023091；许可证号：0019777。二、实验方法(一)模型制备在乙醚(醇)吸入麻醉下,分离左颈总动脉并结扎,缝合切口后放回鼠笼中2h,后置于37℃恒温水浴密闭容器中,以1L／min的速度通入8%氧气+92%氮气的混合气体,2.5h后取出,1h后作行为测定,翻身不能,平衡异常和左旋者视为成功模型,随机分为6组,并送回鼠笼中饲养。假手术组麻醉后分离左颈总动脉,但不结扎,术后亦不作低氧处理,行为测定无异常。(二)分组及治疗方法1.针刺组：所有需要针刺治疗的小鼠针四肢及头部穴位。以直径2mm,长20mm的针灸针,先在“内关”、“涌泉”速刺不留针,然后针四肢及头部穴位。四肢穴位“曲池”、“足三里”穴针1分深左右,头部穴位“百会”、“颞Ⅰ针”平刺,进针后觉针下沉紧即可,留针10min。2.艾灸组：点燃无烟艾条后,温和灸“督脉”10分钟。3.针刺+艾灸组：同时行针刺组与艾灸组的治疗。4.正常组、假手术组、模型组不予以任何治疗。(三)定位方法：穴位定位参照《实验针灸学》,结合人与动物骨度类比：“督脉”为尾根与肛门之间的凹陷中；顶骨正中定“百会”；外耳道口直上0.8cm处模拟“颞Ⅰ针”；桡骨近端的关节外侧,离腕关节约3mm左右的尺桡骨缝间取“内关”；“曲池”位于桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中；“足三里”在膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处；后肢掌心前正中取“涌泉”。(四)时间安排手术当天称重,术后1d休息,术后2d检测悬吊试验和斜坡试验,术后3d开始治疗6天,术后9d检测悬吊试验和斜坡试验,术后10再次治疗6天,术后16d检测悬吊试验和斜坡试验,术后18d称重。三、指标观测(一)行为运动能力及学习记忆能力测试(二)脑组织病理学形态(三)脑组织细胞超微结构观察(四)脑组织中单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)及5-羟色胺(5-HT)的含量(五)脑组织中兴奋性氨基酸(Glu)和抑制性氨基酸(GABA)的含量结果一、体重变化、行为学与学习记忆能力测试(一)体重变化正常组,假手术组,艾灸组,针刺+艾灸组这四组之间体重增加趋势没统计学差异,模型组与单纯针刺组之间也无统计学差异。而前四组与后两组相比,P<0.01,体重增加的趋势有统计学意义。(二)行为学与学习记忆能力测试1.行为学测试组间处理效应统计检验结果：OHT：F=2.34002,P<0.01；IPT：F=8.88629,P<0.01。不同处理方法对CP幼鼠肌力,平衡能力增长的差异有统计意义。而因素time和处理方法的交互作用P<0.01,可以认为不同处理方法对CP幼鼠肌力,平衡能力增长的促进作用是不同的。不同组别间(处理方法单独作用),悬吊试验结果：假手术组>正常组>针刺+灸组>艾灸组>模型组>单纯针刺组；斜坡试验结果：模型组>单纯针刺组>艾灸组>针刺+灸组>假手术组>正常组。因素time和处理方法的交互作用,悬吊试验结果：假手术组>正常组>针刺+艾灸组>艾灸组>模型组>单纯针刺组；斜坡试验结果：模型组>单纯针刺组>艾灸组>针刺+灸组>假手术组>正常组。2.学习记忆能力(Y迷宫试验)测试经方差分析结果显示：不同处理组间,F=2.18793,P<0.01。多重比较结果显示：正常组>假手术组>针刺+灸组>艾灸组>单纯针刺组>模型组。表5提示：治疗组学习记忆能力同模型组差异有统计学意义。表明针刺、艾灸可改善脑瘫幼鼠的学习记忆能力。二、脑组织病理形态学观察及细胞数(一)HE染色观察HE染色观察：普通光镜10×20倍下随机观察每张切片5个视野内脑缺血后病理变化情况。各组实验大鼠脑组织病理形态学改变：脑组织常规石蜡切片,HE染色后,神经细胞胞浆呈淡紫色,核呈蓝黑色。正常对照组及假手术组皮层脑细胞结构正常,胞核清晰,细胞核圆而大,核仁清晰。胞浆丰富,间质无水肿表现。模型组可见部分神经元变性,体积变小,细胞核,出现核固缩,胶质细胞有增生,胞核与胞浆界限模糊,核固缩成三角形或不规则形,核仁消失。针刺组、艾灸组及针刺结合艾灸治疗组仍有不同程度的神经细胞变性,但变性神经细胞数量显著减少,偶见损伤细胞。(二)各组大鼠脑皮质正常神经细胞数目计较情况各组大鼠脑皮质正常神经细胞数目比较结果示：假手术组与正常对照组比较(P>0.05)差异无统计学意义；假手术组与模型组对照(P<0.01)差异有显著的统计学意义；针刺组、艾灸组、针刺+艾灸组与模型组对照(P<0.05)差异有统计学意义,且针刺组、艾灸组、针刺+艾灸组正常神经细胞数目均高于模型组。针刺组、艾灸组、针刺+艾灸组三者之间对照(P>0.05)差异均无统计学意义。三、脑组织细胞超微结构观察正常组：神经细胞胞体完整,细胞核呈圆形,核膜光滑无皱褶,有核孔,核周间隙均匀,核内染色质分布均匀,核内常染色质丰富,偶见核仁,胞质中富含各种细胞器丰富,形态正常,结构完整。假手术组：神经细胞胞体,细胞间质内偶有空隙,细胞核呈圆形或卵圆形,膜结构清晰、规则,核周间隙均匀,核内染色质分布均匀,偶见异染色质；胞质内细胞器丰富,结构完整,可见高尔基体呈扁平囊泡平行排列；线粒体呈圆形、椭圆形,膜规则,基质均匀；内质网核糖体丰富。模型组：神经细胞核膜多呈不规则形状,核内细胞器显著减少,细胞固缩,异染色质凝集成块状；线粒体减少,肿胀成球形,透明成空泡；粗面内质网扩张,表面核糖体脱落；高尔基体分布稀疏、散乱,其囊腔明显扩张。针刺组：神经细胞核膜尚规则,核内染色质仍有凝集,胞质内可见大量线粒体,形态基本正常,偶有肿胀,空化；胞质内可见粗面内质网、高尔基体有空泡样改变,分布散乱；艾灸组：神经细胞核膜尚规则,胞质内常染色质均匀,偶见异染色质,胞质内可见大量线粒体,形态基本正常,少量肿胀、空化；内质网核糖体较丰富。针刺+艾灸组：神经细胞核膜尚规则,胞质内常染色质丰富,可见大量线粒体,基质较均匀,偶有肿胀；胞质内粗面内质网、高尔基体囊腔少数略有扩张。四、脑组织中单胺类神经递质NE、DA及5-HT正常对照组与假手术组对照的差异没有统计学意义(P>0.05)；正常对照组与模型组对照的的差异有统计学意义(P<0.05),且正常对照组脑组织中NE、DA及5-HT的含量较模型组为高。模型组与假手术组对照的差异有统计学意义(P<0.05),且假手术组脑组织中NE、DA及5-HT的含量较模型组为高；模型组与针刺组、艾灸组、针刺+艾灸组三者之间对照的差异均有统计学意义(P<0.05),且针刺组、艾灸组、针刺结合艾灸组脑组织中NE、DA及5-HT的含量均较模型组为高。针刺组、艾灸组与针刺+艾灸组三者之间对照的差异无统计学意义(P>0.05)。五、脑组织中兴奋性氨基酸(Glu)和抑制性氨基酸(GABA)正常对照组与假手术组对照的差异没有统计学意义(P>0.05)；正常对照组与模型组对照的差异有统计学意义(P<0.05),且正常对照组脑组织中Glu的含量较模型组为低,GABA的含量较模型组为高；模型组与假手术组对照的差异有统计学意义(P<0.05),且模型组脑组织中Glu的含量较假手术组为高,GABA含量较假手术组为低；模型组与针刺组、艾灸组、针刺+艾灸组对照的差异均有统计学意义(P<0.05),且模型组脑组织中Glu的含量均较针刺组、艾灸组、针刺结合艾灸组为高,GABA含量均较针刺组、艾灸组、针刺结合艾灸组为低。针刺组、艾灸组与针刺+艾灸组三者之间对照差异无统计学意义(P>0.05)。结论一、艾灸、针刺结合艾灸对CP幼鼠的体重增加有促进作用,它们两者之间没差异,使其体重增加速度和幅度与正常和假手术幼鼠相当。单纯针刺在这次实验中没发现有作用,原因需进一步研究；艾灸、针刺均对CP模型幼鼠的肌力和平衡能力增长有促进作用,而针刺结合艾灸后效果更佳；同样,艾灸对CP模型幼鼠的学习记忆能力改善有促进作用,而针灸结合后效果更佳。二、本研究中,艾灸组、针刺组、针刺+艾灸组的正常神经细胞数目均较模型组多,且三者之间的差异不明显。表明艾灸、针刺或针灸结合在一定程度上可抑制脑缺氧缺血后脑内神经细胞的凋亡,对缺氧缺血脑损伤具有一定的保护作用,而且越早干预效果越好。三、本研究通过电镜超微结构观察显示CP模型幼鼠存在神经细胞的损伤,应用艾灸、针刺或针灸结合治疗后,对受损神经细胞有一定的修复作用,为针灸治疗小儿脑瘫提供了实验依据。四、经艾灸、针刺或针灸结合治疗后,脑瘫幼鼠脑组织中NE、DA、5-HT含量明显升高,且三者的治疗效果相当。因此,可以推断：升高相关脑组织中单胺类神经递质含量可能是针灸治疗幼鼠脑瘫痪的作用机制之一。五、本研究中,模型组幼鼠脑组织中Glu含量显著高于假手术组,GABA含量显著低于假手术组,从而推断出Glu的兴奋性毒性和GABA的抗兴奋性毒性作用可能均参与了脑瘫的病理生理过程。治疗组与模型组比较,脑组织中Glu含量显著降低,提示CP模型幼鼠接受艾灸、针刺或针灸结合治疗后,均可降低或减少缺血脑组织中Glu的含量,发挥脑保护作用；治疗组幼鼠脑组织中GABA含量显著升高,表明艾灸、针刺或针灸结合治疗可通过提高GABA的含量对抗Glu引起的兴奋性毒性,且三者之间的作用效果无显著差异。因此,在治疗CP过程中,维持兴奋性神经递质和抑制性神经递质的动态平衡可能是针灸发挥作用的机制之一。