马铃薯立枯丝核菌毒素的分离鉴定及对茎溃疡的致病机理研究

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近年来随着马铃薯产业的迅猛发展,我国马铃薯主产区土传病害日趋加重,尤其是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引起的马铃薯茎溃疡病(也称马铃薯立枯病,Potato Rhizoctonia canker,黑痣病,black scurf)已成为影响马铃薯产业发展的限制因子,不仅严重影响马铃薯块茎的产量和品质,降低其商品性和贮藏性,也给种植户造成了巨大的经济损失。立枯丝核菌对马铃薯植株的致病机理十分复杂,产生的毒素可能是其致病的关键因子,探明立枯丝核菌毒素在植株发病过程中的作用,对防治马铃薯黑痣病具有重要意义。本研究拟采用高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、柱层析、红外光谱(FTIR)、质谱和核磁(NMR)分析等手段分离和鉴定病原菌毒素的活性成分,同时用毒素处理马铃薯茎基部,综合采用植物病理学、生理学和细胞生物学等多学科的方法,揭示病原菌毒素对马铃薯茎溃疡的致病机理,为更有效地防治马铃薯茎溃疡病提供理论依据。主要试验结果如下:1.立枯丝核菌AG-3毒素的分离和鉴定(1)将分离到的38个样品进行TLC分析,在254nm紫外光下可以看见清晰的斑点,制备TLC的最佳展开剂为乙酸乙酯/石油醚=5:1v/v;(2)对38个样品进行植物毒性实验,发现2号、25号、49号和50号4个样品对植物具有致病性;对1-4样品分别进行了HPLC分离分析,初步确定该4个具有致毒作用样品中可能含有7个成分;红外分析结果发现,4个样品所含组分的分子结构中含有以下官能团:2962.1 cm-1(-CH3),1465.6 cm-1(-CH2-),1727.9 cm-1(C=O),1729.8 cm-1(-COOH)和1124.3 cm-1(-OH)。(3)对1-4号样品进行质谱分析,分析结果表明,4个样品具有较高的分子量,1、2和3-4号样品的分子量分别为1088、550和817。(4)对毒性最大的1号样品进一步通过高效液相色谱结合核磁共振进行分离和鉴定,发现病原菌毒素的核心物质为3-(甲硫基)丙酸(MTPA)和3-(甲硫基)丙烯酸(MTAA)。2.立枯丝核菌毒素成分3-(甲硫基)丙酸的致病性研究设置五个浓度的3-(甲硫基)丙酸进行盆栽实验,0,1,2,4 and 8 mmol﹒L-1的3-(甲硫基)丙酸。结果表明:与对照组相比较3-(甲硫基)丙酸可显著抑制植物的生长及块茎产量。用8 mmol﹒L-1的3-(甲硫基)丙酸处理的植株,相对于对照组其地上新鲜植物重量和地下新鲜植物重量分别减少了260.14%和395.95%,块茎的产量下降了419.12%,单个块茎的质量下降了100.22%,马铃薯植株的生物量下降了112.44%。马铃薯种子用1.0-8.0 mmol﹒L-1 3-(甲硫基)丙酸处理后,其根部坏死面积达到80%。马铃薯种子用8.0 mmol﹒L-1 3-(甲硫基)酸处理后匍匐枝及茎部溃疡高达97.78%和97.10%,相比较对照组,黑腐病的发病率增加了94.59%。上述研究表明,在缺乏真菌的条件下,立枯丝核菌的代谢产物3-(甲硫基)丙酸能够诱导植物产生溃疡及黑腐病。3.立枯丝核菌毒素对马铃薯溃疡组织抗氧化活性酶的影响实验结果表明,用立枯丝核菌毒素处理马铃薯植株后,植株的抗氧化酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶及过氧化氢酶)的活性分别增加了86.95,203.64,和123.28%,几丁质酶在植物的根、茎及叶中活性分别增加了120.22,145.45,和143.91%,而丙二醛(MDA)的含量在根、茎及叶中下降了167.80、156.52和158.30%。表明植物毒素和抗氧化酶参与了立枯丝核菌致病的机理。
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