论文部分内容阅读
目的： 磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein,PLTP)是调节脂蛋白代谢的重要血浆蛋白，血浆PLTP活性增高见于糖尿病、代谢综合征、高血压等多种慢性病，而上述慢性病均是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)AS性心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)高发人群。我们的前期研究表明PLTP缺乏时，腺病毒介导的PLTP过表达能通过促进巨噬细胞凋亡降低载脂蛋白E(apolipoprotein,apoE)敲除鼠AS斑块稳定性。尽管自然界中尚未发现PLTP缺乏个体，但上述研究提示PLTP极可能影响AS斑块稳定性。为明确PLTP活性升高对斑块稳定性的作用及机制，采用PLTP过表达的apoE敲除鼠为模型，通过组织学、分子生物学手段研究系统性PLTP活性升高影响斑块稳定性的机制，以明确PLTP活性升高对斑块稳定性的作用。通过对实验小鼠的磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MR)研究，探索使用小动物线圈检测早期动脉粥样硬化的价值。 方法： 1、取8周龄雄性apoE-/-小鼠15只，雌性apoE-/-小鼠20只，分别与PLTP-Tg雌、雄性小鼠(雌雄比例：2-3:1）基因型鉴定及表型鉴定后杂交繁殖，从获取apoE-/-及apoE-/-&PLTP-Tg型小鼠，随机分为apoE-/-组(E-/-,n=13)和apoE-/-&PLTP-Tg组(E-/-&P-Tg,n=10),给予高脂饲料喂养11周。 2、模型鼠高脂喂养11周禁食12小时，麻醉后行内眦静脉取血，采用酶法检测总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。 3、心脏及主动脉取材，包埋心底制备主动脉根部冰冻切片；行主动脉内膜油红O染色及主动脉根部油红O染色及HE染色，采集图像并行主动脉内膜和主动脉根部斑块面积统计分析。 4、免疫组化法检测E-/-及E-/-&P-Tg小鼠主动脉根部冰冻切片斑块部位的巨噬细胞(macrophage,用MOMA-2抗体标记)、平滑肌细胞(Smooth muscle cells,用α-actin抗体标记)、和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的含量差异；参考(平滑肌细胞面积+胶原纤维胶原面积)/(巨噬细胞面积+脂质面积)斑块稳定性评分公式对斑块稳定性进行评分。 5、PLTP过表达骨髓源性巨噬细胞(Bone Marrow-derived Macrophage,BMDM)对ox-LDL吞噬情况，行细胞油红O染色检测分析细胞脂质蓄积变化，蛋白免疫印迹技术(Western Blot)法检测代谢相关基因蛋白：ABCA1(ATP binding cASsette transporter A1,ABCA1)、SRBI(Scavenger Receptor Class BI,SRBI)、SRA(Scavenger Receptor Class A,SRA)、CD36(Cluster of Differentiation36,CD36)、SREBP1(Sterol Regulatory Element-binding Protein1,SREBP1)、LXR-α(Liver X Receptor-α,LXR-α)等蛋白的表达。 6、PLTP过表达BMDM吞噬ox-LDL，检测内质网应激GRP78(Glucose regulated protein78,GRP78)等蛋白的表达。 7、体外检测ox-LDL引起BMDM分泌MMP-9活性，BMDM对ox-LDL引起MMP-9的影响。 8、使用3.0T MRI及小动物线圈检查活体模型鼠主动脉。 9、通过计量资料两组之间比较采用独立样本t检验：多组样本之间比较时，采用方差分析(ANOVA）。各组数据用SPSS16.0软件进行统计。以(P＜0.05)表示差异有统计学意义。 结果： 1、E-/-组及E-/-&P-Tg组脂质含量相比较，血脂各项指标显示总胆固醇含量E-/-&P-Tg组较E-/-组低，有显著性差异(P＜0.05)；两组肝脏脂质各项指标无明显差异(P>0.05)。各组小鼠体重检测未见明显统计学差异。 2、各组E-/-及E-/-&P-Tg小鼠主动脉在体拍照显示，E-/-&P-Tg组较E-/-组主动脉斑块生长明显，与主动脉弓分叉处外观，E-/-&P-Tg小鼠主动脉瓷白色动脉硬化斑块均明显多于E-/-小鼠；油红O结果显示E-/-&P-Tg组较E-/-组主动脉全长和主动脉根部斑块负荷明显升高(P＜0.05)；HE染色结果显示：E-/-&P-Tg组较E-/-组斑块面积明显增大(P＜0.01)。 3、E-/-及E-/-&P-Tg组比较主动脉根部斑块中胶原和平滑肌细胞的含量未见明显变化(P>0.05)，E-/-&P-Tg组较E-/-组巨噬细胞含量是明显增加(P＜0.05)；E-/-&P-Tg组可显著降低斑块稳定性评分。 4、PLTP过表达BMDM对ox-LDL吞噬行细胞油红O染色显示脂质蓄积明显增加(P＜0.05)。 5、PLTP过表达BMDM吞噬ox-LDL可明显影响ABCA1、SRBI、CD36等蛋白的表达(P＜0.05)。 6、PLTP过表达可促进内质网分子伴侣GRP78表达(P＜0.05)。 7、3.0T MRI检查两组小鼠主动脉，心血管解剖结构尚可，动脉壁厚度及动脉粥样硬化斑块形态的显示不理想，测量两组小鼠主动脉弓管径，E-/-&P-Tg组较E-/-组主动脉管径明显变窄。 8、两组斑块内MMP-9表达未见明显差异(P>0.05)；WT与PLTP-Tg骨髓源性巨噬细胞分泌MMP-9活性及ox-LDL引起BMDM分泌MMP-9活性未见明显差异(P>0.05)。 结论： 1、PLTP过表达可促进E-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的发展及显著降低斑块稳定性； 2、其机制与PLTP通过促进巨噬细胞内脂质蓄积，内质网应激上调CD36途径达成； 3、PLTP过表达下调ABCA1和SRBI与胞内脂质含量多，进而抑制SREBP1-LXR途径有关； 4、3.0T MRI显示心血管解剖结构尚可，动脉壁厚度及动脉粥样硬化斑块形态的显示不理想，PLTP过表达后较E-/-组主动脉管径变窄。