目的：肾癌是泌尿系统发病率仅次于膀胱肿瘤的恶性肿瘤,严重危害人类健康。约2/3以上的肾癌为透明细胞癌,起源于肾实质泌尿小管上皮系统。研究发现,60-80%肾透明细胞癌的希佩尔-林道（Von Hippel Lindau,VHL）双等位基因失活,可导致细胞内低氧诱导因子（Hypoxia induced factor,HIF）的异常积累。目前,尽管外科手术技术和放化疗技术不断进步,但肾癌初次诊断时大多处于中晚期,预后不好。因此根据肾癌的生物学特性和病理特征进行个性化治疗,进一步寻求潜在的分子靶基因有十分重要的意义。Notch3作为跨膜蛋白,与邻近细胞配体结合后,Notch受体激活,经过3次酶切,形成胞内段（Notch intracellular domain,NICD）,后者进入细胞核,与转录因子结合调节下游靶基因的转录,从而参与细胞增殖、分化等功能的调节。目前,Notch3在肾癌中的研究报道较少,其与肾癌内HIF表达的关系,及其参与肾癌发生发展的生物学作用尚不明确。本研究应用免疫组织化学的方法检测Notch3和HIF蛋白在肾癌及癌旁组织中表达情况,及表达与临床病理因素之间的关系;进一步通过抑制Notch3胞内段的表达和基因沉默的方法研究其对肾癌细胞系调节作用和机制。研究方法1、收集自2012年1月至2019年10月于北部战区总医院和平院区泌尿外科行肾脏肿瘤切除术,术后病理诊断为肾透明细胞癌的标本57例,其中男47例,女10例,中位年龄58岁。标本经福尔马林固定,制作石蜡切片,HE染色后经病理医师明确诊断,且依据2010年美国癌症联合会（AJCC）标准进行临床TNM分期。2、免疫组织化学染色方法（SP法）检测Notch3和HIF-1蛋白在肾癌及癌旁组织中的表达,其与临床病理因素之间的关系,及二者表达的相关性。常规的石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后,柠檬酸溶液内95℃加热15min抗原修复,适量双氧水灭活内源性过氧化物酶,正常山羊血清孵育封闭非特异性结合,Notch3抗体（1:200）或HIF-1α抗体（1:400）4℃孵育过夜,兔免疫球蛋白作阴性对照;PBS冲洗后,生物素标记的羊抗兔血清Ig G室温孵育15 min,滴加链霉菌抗生物素蛋白室温孵育30 min,PBS冲洗3次,滴加DAB显色,显微镜下观察染色变化,蒸馏水冲洗结束显色;常规苏木素核复染,脱水,透明,封片。免疫组化染色结果采用双盲法由两位病理科医师,在高倍光学显微镜下随机选择10个视野,每个视野统计100个完整的肿瘤细胞,当细胞染色强度明显大于非特异性背景染色时判定为阳性。分别按阳性细胞占全部计数细胞的比例进行评分:≤5%记0分、5%-25%记1分、26%-50%记2分、51%-75%记3分、>75%记4分;按细胞染色程度评分:未着色记0分、浅黄色记1分、棕黄色记2分、棕褐色记3分。最终,将阳性细胞比例的得分和染色强度的得分相加用来评定目标蛋白表达的强度,当其≤3时记作低表达,当其>3时记作高表达。3、细胞培养和RO4929097处理:786-O和ACHN细胞系分别在含有10%胎牛血清的RPMI1640和MEM培养基中培养。γ分泌酶抑制剂RO49029097分别以终浓度5μm、10μm、20μm加入细胞,混匀后,放入37℃培养箱中培养48 h,收集细胞,进行蛋白电泳检测Notch3胞内段的表达。4、低氧培养:对照细胞及加药后细胞,放于37℃、5%CO2、2%O2孵箱培养48h,模拟低氧培养环境;200μM氯化钴处理细胞模拟低氧培养环境刺激。5、细胞转染:已构建的Notch3过表达质粒p3x FLAG-CMV-14-NICD3和对照质粒p3x FLAG-CMV-14分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细菌中,扩增、提取、纯化。根据Lipofectamine3000说明优化转染条件,转染48小时后收集细胞进行后续实验。6、稳定敲减Notch3基因细胞克隆的建立:利用Polybrene（?）辅助包装有Notch3sh RNA的慢病毒颗粒感染786-O细胞（5x105 IFU/ml）;感染后48h,加入终浓度2μg/μl的嘌呤霉素,每隔2-3d更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液,筛选2周后挑选克隆,蛋白电泳鉴定后,扩大培养,用于后续实验。7、CCK8分析:细胞铺在含有10%胎牛血清培养液的96孔板中,培养48h后,加20μl CCK8溶液孵育细胞4h后,利用酶标仪测定490nm波长处样品吸光度值。8、Ed U参入法:786-0和ACHN细胞加药后,分别在常氧或低氧培养48h,然后根据试剂盒说明,依次加入稀释的Ed U溶液、多聚甲醛、甘氨酸、透膜液、Apollo染色、Hoechst33342反应液,最后荧光显微镜下观察成像计数阳性细胞比例或流式细胞仪检测阳性细胞比例。9、细胞克隆形成实验:细胞处理后,分别在常氧或低氧培养10d后,应用10%亚甲基蓝染色,PBS溶液冲洗后,实体显微镜观察成像,Imagepro plus软件测定克隆集落数染色的整合光密度值。10、细胞周期分析:收集处理后的786-0和ACHN细胞,70%乙醇-20℃固定,碘化丙啶染色,流式细胞仪检测细胞各周期所占比例。11、线粒体膜电位分析:收集处理后的786-0和ACHN细胞,JC-1工作液染色后,流式细胞仪检测线粒体膜电位降低细胞所占比例。12、Western blot分析:利用RIPA裂解缓冲液提取细胞的总蛋白,Bradford法检测蛋白浓度。总量为50μg的蛋白样品经10%SDS-PAGE电泳分离,蛋白转印至PVDF膜后,分别与Notch3、cyclin D1、CDK4、HIF-2α、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、p-m TOR、m TOR、pp70S6K、p70S6K和ACTIN 4°C孵育过夜;洗涤后,分别加入辣根过氧化物酶标记的抗兔/鼠二抗室温孵育2 h,化学发光成像,用Image J3.0软件测量灰度值,进行半定量分析。13、统计分析:采用SPSS11.5统计分析软件,对Notch3和HIF-1α表达和临床病理因素之间的关系用χ2检验,本实验其它结果采用t检验进行数据分析,用平均值±标准差（mean±SD）表示,P<0.05为差异显著,用Graph prime5.0做图。结果1、Notch3和HIF-1α在肾癌中高表达,且与临床病理分期及分化程度相关,但与性别、年龄、淋巴结转移情况无关;Notch3和HIF-1α在肾癌中的表达具有一定的正相关性。⑴Notch3主要在细胞核内染色,在肾透明细胞癌组织及其对应的癌旁正常组织中表达率分别为80.70%（46/57）与26.31%（15/57）,表达差异具有统计学意义（χ2=33.886,P=0.000）。⑵HIF-1α主要在细胞浆和细胞膜内表达,在肾透明细胞癌组织及其对应的癌旁正常组织中高表达率分别为56.14%（32/57）与14.04%（8/57）,表达差异具有统计学意义（χ2=22.184,P=0.000）。（3）Notch3在各临床病理学分级的高表达率分别为高分化90.63%,中分化68.00%,Notch3在各临床病理学分级的高表达差异具有显著统计学意义（χ2=4.613,P=0.045）;Notch3在各临床分期的高表达率分别为Ⅰ期61.90%,Ⅱ期91.67%,Ⅲ期87.50%,Ⅳ期100.00%,Notch3在临床TNM分期的高表达率无显著统计学差异（χ2=6.455,P=0.065）。（4）HIF-1α在各临床病理学分级的高表达率分别为高分化68.75%,中分化40.00%,HIF-1α在各临床病理学分级具有显著统计学差异（χ2=4.711,P=0.030）;HIF-1α在各临床分期的高表达率分别为Ⅰ期28.58%,Ⅱ期70.83%,Ⅲ期75.00%,Ⅳ期75.00%,HIF-1α在临床TNM分期上具有显著统计学差异（χ2=9.965,P=0.012）。（5）卡方检验的列联分析显示,肾透明细胞癌组织中Notch3与HIF-1α蛋白表达水平具有一定的正相关性（φ=0.264,P=0.005）。2、Notch3信号调节常氧、低氧微环境下肾癌细胞增殖的作用和机制。⑴γ-分泌酶抑制剂RO4929097处理肾癌细胞,降低肾透明细胞癌786-O和ACHN细胞内Notch3胞内段的表达,且具有浓度依赖性。（2）低氧诱导肾癌细胞的增殖,RO4929097处理抑制细胞增殖:CCK-8分析显示低氧显著诱导786-O对照组细胞的增殖（P<0.01）,而在ACHN细胞并不明显,而对于两种细胞的RO4929097处理组,低氧并无显著的促进增殖作用;RO4929097处理显著抑制常氧、低氧微环境下786-O和ACHN细胞的增殖（P<0.05）。Ed U掺入实验显示,低氧显著提高两个细胞系在对照组和RO4929097处理组Ed U阳性细胞数（P<0.01）;RO4929097处理减少常氧、低氧微环境下Ed U阳性细胞数,且RO4929097在低氧微环境下的作用明显高于常氧微环境（P<0.05）。在细胞克隆形成实验中,786-O和ACHN细胞形成的细胞集落较散,集落甲基蓝染色的整合光密度值（integrated optical density,IOD）分析显示,RO4929097处理抑制786-O细胞克隆形成,在ACHN并不明显;低氧微环境促进两个细胞系的克隆形成,且RO4929097处理明显抑制克隆形成（均P<0.05）。（3）RO4929097调节常氧、低氧微环境下肾癌细胞的细胞周期:低氧培养降低786-O对照细胞G0+G1期细胞比例（P<0.05）。而RO4929097处理显著提高786-O和ACHN细胞在常氧微环境（P<0.05）和低氧微环境下G0+G1期细胞比例（P<0.01）,且RO4929097在低氧微环境下的作用较为明显。同时,蛋白免疫印迹分析表明低氧显著上调对照细胞的cyclin D1和CDK4表达（均P<0.01）;在常氧及低氧条件下,RO4929097处理下调cyclin D1和CDK4的表达（P<0.01）。3、在786-O和ACHN细胞,Notch3与HIF-2α存在相互作用。（1）构建包含NICD3编码序列的载体,转染786-O和ACHN细胞,转染效率分别为47.0%和168.1%。（2）低氧培养未明显影响全长Notch3（full length,FL）,含有跨膜片段的NICD3（transmembrane domain,TD）及NICD3蛋白的表达。（3）Notch3调节2%O2培养诱导的HIF-2α蛋白表达:在786-O细胞系,2%O2诱导HIF-2α蛋白表达上升（P<0.01）,而200μM Co Cl2处理对HIF-2α蛋白表达没有明显作用;在ACHN细胞,200μM Co Cl2 and 2%O2处理均上调了HIF-2α蛋白表达（P<0.01）。在2%O2培养条件下,RO4929097处理明显降低HIF-2α蛋白表达（P<0.01）,NICD3过表达质粒转染“挽救”HIF-2α蛋白表达。（4）低氧条件下NICD3过度表达质粒转染挽救RO4929097抑制的cyclin D1、CDK4和PCNA蛋白表达（P<0.01）。4、稳定敲减Notch3基因的786-O细胞系的建立:（1）靶向Notch3基因的sh RNA转染786-O细胞,嘌呤霉素筛选的细胞克隆经Western blotting鉴定Notch3基因表达下降70%;Ed U参入实验和流式细胞仪检测显示敲减Notch3基因表达抑制细胞增殖。（2）低氧培养提高m TOR、p70S6K、pp70S6K表达（P<0.05）,pm TOR表达无显著差异;常氧条件,敲减Notch3基因表达显著减低mTOR、pmTOR、p70S6K、pp70S6K表达（P<0.05）,而且低氧条件下敲减Notch3基因表达显著减低磷酸化m TOR和p70S6K的表达（P<0.01）,且抑制作用大于常氧条件。（3）基因敲减Notch3促进肾透明细胞癌常氧、低氧微环境下的细胞凋亡（P<0.01）。结论1、Notch3和HIF-1α在肾透明细胞癌组织中高表达,且与临床病理分期及分化程度相关,二者的表达存在一定的正相关。2、抑制Notch3胞内段的产生,可能通过对细胞周期的调节,抑制常氧、低氧条件下的肾透明细胞癌细胞的增殖。3、在肾透明细胞癌Notch3和HIF-2α间存在相互作用。4、Notch3基因敲减786-O细胞系的建立,为后续深入研究Notch3在肾透明细胞癌作用机制奠定基础。5、基因敲减Notch3通过抑制m TOR信号通路,促进肾透明细胞癌细胞的凋亡。