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研究背景:钛及钛合金因其良好的机械性能、抗腐蚀性、生物相容性在近几十年来被广泛应用作骨科和牙科植入材料。快速的骨结合被认为是种植成功的关键,但因材料表面本身的生物惰性、高弹性模量和有限的生物学效应而备受限制[1-3]。因此,如何改善钛种植体的性能,促进和加速骨结合仍旧是近年来众多学者的研究重点。近年来,多孔结构因可以适当降低钛种植体的杨氏模量,减少其应力遮挡效应的损伤而在医疗领域引起了极大的关注[1,4-7]。纳米技术的飞速发展更使得骨相关疾病的治疗发生了革命性的变化。因骨本身是初级结构单元为纳米级的多级结构生物材料[8],所以对人工生物替代材料表面进行纳米形貌改性,构建多级仿生结构,模拟细胞生长的生理微环境,被认为在骨组织工程研究中具有重大意义[9]。目的:1设计从宏观到微米级再到纳米级的金属纯钛多级仿生结构;2基于多级仿生结构,构建纳米药物释放系统,评价其药物释放的性能及其对体内外成骨效应的影响。方法:根据计算机辅助设计（Computer-Aided Design;CAD）建立多孔模型,利用3D（Three-dimensional）打印技术制备类骨小梁多孔钛支架（porous titanium scaffold;p-Ti）,获得支架宏观和微米级结构,再通过阳极氧化法生成TiO2纳米管进一步修饰多孔钛支架（porous titanium scaffold modified by TiO2 nanotubes;p-TNTs）,从而获得钛多级仿生结构。采用浸泡法和滴加法负载药物1α,25（OH）2D3（1α,25-dihydroxyvitamin D3;VD3）和涂覆温敏水凝胶F-127（pluronic F-127;F-127）于p-TNTs表面,构建纳米药物释放系统（p-TNTs+VD3+F-127;Nanoscale drug delivery systems;NDDSs）。1材料表征及药物释放:场发射扫描电镜（Field emission scanning electron microscopy;FE-SEM）和聚焦离子束扫描电镜（Focused ion beam scanning electron microscope;FIB-SEM）观察各组材料的表面形貌和表面横截面形貌;接触角实验测试材料表面的亲疏水性;X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy;XPS）和傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform infrared spectroscopy;FTIR）进一步验证VD3和F-127是否被成功地负载于材料表面;酶标仪检测药物吸光度值（Optical density;OD）用于评价NDDSs的药物释放性能。2体外细胞实验:FE-SEM观察细胞在材料表面培养24h后的生长形态;活-死细胞染色实验（1d）和细胞计数实验（Cell Counting Kit-8;CCK-8）（1d和3d）被用于检测细胞的活力和增殖情况;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Polymerase Chain Reaction;Real-time PCR）检测细胞在各组材料表面诱导7d后,成骨相关基因碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase;ALP）、I型胶原蛋白（Collagen type I;COL-I）、Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2;RUNX2）和成骨相关转录因子（Osterix;OSX）的表达情况。3体内动物实验:将各组材料植入新西兰大白兔股骨远心端,分别在术后第6天和第10天肌肉注射茜素红和钙黄绿素体内荧光标记物,2周后取材,制作硬组织切片,激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy;CLSM）下观察荧光标记的新骨形成情况,亚甲基蓝-酸性品红（Von-Gieson;VG）染色后进一步分析体内成骨效应。结果:本实验成功制造了用于体外实验的片状多孔钛和用于体内实验的柱状多孔钛。1材料表征及药物释放:FE-SEM结果显示从纳米结构TNTs到微米级的微球颗粒再到宏观多孔结构的独特的3D多级仿生结构被成功构建,FIB-SEM的结果表明在钛基底平面和球形表面均可修饰TiO2纳米管（TiO2 nanotubes;TNTs）;接触角实验表明p-TNTs表面亲水性显著优于p-Ti,负载两亲性水凝胶F-127后,p-TNTs和p-Ti之间亲疏水性的差异被降低（p<0.01）;XPS和FTIR的结果表明药物和水凝胶均被成功负载于材料表面;药物释放曲线结果显示,虽然最初的12h出现药物暴释现象,但随后在1d到14d药物呈现缓慢释放现象,表明NDDSs具有控释功能。2体外细胞实验:通过FE-SEM观察,MC3T3-E1细胞在NDDSs表面伸出大量丝状伪足;活-死细胞染色实验和CCK-8实验结果表明,除p-Ti+VD3+F-127组外,MC3T3-E1细胞在余材料表面均有良好的活力和增殖能力,但TNTs和/或VD3使得细胞的增殖速率减慢（p<0.05）;MC3T3-E1细胞在NDDSs表面培养7d后,成骨相关基因ALP、COL-I、RUNX2和OSX的表达量明显上调（p<0.05）。3体内动物实验:VG染色结果显示各组材料周围均可生成新生骨,但早期在NDDSs周围生成的骨与支架结合更紧密,孔隙内的新骨量（13.9±2.9%）也明显多于其他各组（p<0.05）;荧光序列标记的结果与VG染色结果相似,此外,在p-TNTs（3±0.8%）和NDDSs（2.4±0.7%）组还观察到少量茜素红标记的新骨形成（红色）,表明TNTs纳米拓扑结构和可控的VD3释放更有利于促进早期成骨效应（p<0.05）。结论:本实验成功构建了多级仿生钛支架和负载VD3的纳米药物释放系统,其具有良好的生物相容性和体内外诱导成骨的能力,对促进早期骨结合具有潜在价值,为生物植入物的设计和功能化提供了一定思路。