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烯键还原酶(enoate reductases,ERs)是一种具有潜在应用价值的酶类,属于“老黄酶”家族(“old yellow enzyme”family),广泛分布于微生物和植物中。它能够选择性地还原α,β-不饱和化合物中的碳碳双键,如不饱和醛、酮、硝基烯及其衍生物,催化得到的饱和醛、酮等化合物是农药、食品添加剂和医药的关键中间体。虽然利用ER催化反应具有环境污染少和反应条件温和等优势,但应用中存在一些的问题,如ER在催化反应中消耗昂贵的辅酶和酶较差的稳定性等。针对以上问题,本论文利用三种不同的固定化方法实现了催化反应中的辅酶循环再生,并显著提高了ER的稳定性,它们分别是交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)、仿生固定化(biomimetic immobilization,BI)和纤维素载体共价固定化(cellulose covalent immobilization,CCI)。在交联酶聚集体共固定化酶(ER-GDH-CLEAs)的制备过程中,优化的最佳条件分别是:沉淀剂硫酸铵浓度为4 M、交联剂葡聚醛浓度为15%(v/v)、ER和葡萄糖脱氢酶(GDH)的酶量是11 U和50 U。在此制备条件下,ER-GDH-CLEAs的固定化效率是94.2%,其中ER和GDH的活力回收率分别为44.1%和18.8%。不同条件制备的ER-GDH-CLEAs在扫描电镜(SEM)中显示出不同的结构特征。SEM显示使用葡聚醛相比戊二醛,制得的固定化酶具有多孔性,添加牛血清白蛋白(BSA)进一步增加了这种趋势。结合实验数据发现多孔性的结构可能更加利于底物与酶接触。固定化酶的热稳定性显著提高,如50℃热处理8 h后,ER-GDH-CLEAs中ER相对初始活力保持65.2%,而游离酶仅9.2%。此外,ER-GDH-CLEAs的重复使用性表现十分优异,经过14次重复使用后仍保留114%的相对活力,高于100%的原因可能是酶蛋白在使用中,蛋白的空间构象发生了变化。在仿生共固定化酶(ER-GDH-SPs)的制备过程中,优化的最佳条件分别是:前驱体原硅酸四甲酯(TMOS)浓度为1 M、缓冲液是磷酸缓冲液(50 mM,pH 7.0)、固定化时间为2 h、ER和GDH的酶量是14 U和50 U。在此制备条件下,ER-GDH-SPs的固定化效率是94.7%,其中ER和GDH的活力回收率分别为44.7%和22.3%。SEM显示ER-GDH-SPs为颗粒状的聚集体,结合实验数据(固定化效率高于94%等)推断酶蛋白被包埋其中。由于酶蛋白覆有纳米氧化硅外层而获得优异的稳定性。如50℃热处理8 h后,ER-GDH-SPs中ER保持55.4%的相对活力,而游离酶的活力几乎完全丧失。在重复使用性方面,ER-GDH-SPs经过6次使用后保持近100%的相对活力。在制备纤维素载体共价固定化酶的过程中,优化的最适条件分别是:使用深共熔溶剂(DESs)预处理木质纤维素,并用高碘酸钠、乙二胺(300 mM)和戊二醛(100 mM)对纤维素进行表面修饰,酶的固定化中ER用量为30 mg,缓冲液为Tris-HCl(50 mM,pH 7.5),固定化时间是2 h。在此制备条件下,ER-CCI的固定化效率为95.5%,活力回收率达到47.5%。结合SEM图像,说明预处理后的木质纤维素因为溶解去除了大部分木质素,表面由光滑变得粗糙并有许多孔隙。进一步修饰后,蛋白与载体进行结合,并获得优异的热稳定性。如50℃下热处理8 h后,游离酶的活力减少了91%,而ER-CCI仍保留82.3%。另外,固定化酶在重复使用性上表现较好,8次重复使用后剩余80%的相对活力。为了验证固定化方法的有效性,进行了固定化酶催化的连续反应实验。利用催化还原4-(4-甲氧苯基)-3-丁烯-2-酮的反应作为模型反应,进行了固定化酶对底物的连续转化反应。反应期间添加5次底物(100μM)和1次NAD~+(100μM)。在ER催化的氧化还原反应中,辅酶与底物消耗量的摩尔比为2:1。因为每次添加底物的浓度为100μM,理想状态下反应的产物浓度为50μM。实际上,在ER-GDH-SPs、ER-GDH-CLEAs和纤维素共价固定化酶的催化体系中,最终获得产物的浓度分别为215μM、155μM和105μM,约为理想状态下产物浓度的4倍、3倍和2倍,实验数据说明固定化酶催化反应中的辅酶循环再生的效果良好。总之,三种固定化方法制备的ER固定化酶的固定化效率都高于94%,虽然活力回收率较低(约45%),但与其它类型氧化还原酶类固定化相关报道的数据处于同一水平。目前,ER的固定化制备未见文献报道。