论文部分内容阅读
在养猪业的发展过程中人工授精技术逐渐得到普及,然而精液体外保存技术直接限制人工授精的发展。目前,常见的精液体外保存技术主要包括液氮超低温(-196℃)冷冻保存和15-17℃鲜精体外保存,然而这两种猪精液体外保存技术各有其利弊。近年来,研究发现猪精液4-5℃低温体外保存既可以有效避免猪精子遭受冷冻应激引起的严重损伤,也可以维持猪精液体外受精的产仔数,因此这种保存技术引起了全球范围内的广泛关注。但是,由于低温保存极易对猪精子造成应激伤害,引起精子质膜的脂质发生过氧化反应,造成活性氧离子(Reactive oxygen species,ROS)在精子细胞内富集。因此,寻找适宜的保护剂延长猪精液体外低温保存时间已经成为亟待解决的问题。本研究试图筛选有效的猪精子低温保护剂,并且从氧化应激和蛋白磷酸化角度研究低温保护剂对于维持猪精子活力的作用机理,以期为深入探讨猪精子抗氧化防御机制的分子机理提供理论依据。本研究主要包括三个方面的工作:1、探究精子质膜保护剂牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和脱脂奶粉(Sikm milk,SM)对猪精子体外低温保存的保护作用并探讨具体作用机制。结果发现,BSA和SM通过诱导精子蛋白磷酸化,维持细胞线粒体膜电位,进而提高精子细胞内ATP水平来维持猪精子体外保存的活力参数。此外,BSA和SM两种质膜保护剂对猪精子质量参数的维持作用没有显著差异。因此,本研究证实可以用SM代替BSA作为猪精液稀释液添加成分来降低商业稀释剂的生产成本。此外,在后续的抗氧化剂和抗氧化剂类似物的筛选试验中,本试验在猪精液稀释液中添加了经超声波细胞破碎仪破碎之后的SM作为精液保护成分,以期进一步延长在体外保存条件下猪精子的存活时间。2、探究具有抗氧化作用的黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)、褪黑素(Melatonin,MLT)和纳米碳(Carbon nano-materials,CNMs)对猪精子体外低温保存的保护作用并探讨具体作用机制。结果发现,APS、MLT和CNMs可以增强体外保存猪精子细胞的总抗氧化能力,降低细胞内的ROS水平,缓解ROS对线粒体的应激损伤,从而维持猪精子细胞的线粒体膜电位,提高精子细胞内的ATP水平和各项活力参数。3、为了进一步探究APS、MLT和CNMs具体通过何种方式保护猪精子免受ROS损伤,本实验采用Western Blot的方法进行精子蛋白磷酸化水平检测。结果发现,精子细胞内富集的ROS可以作为蛋白脱磷酸化的分子开关,过量的ROS会促进蛋白脱磷酸化,而外源添加的APS、MLT和CNMs可以通过c AMP-PKA信号通路有效抑制ROS诱导的蛋白脱磷酸化。综上所述,APS、MLT和CNMs三种具有抗氧化作用的物质可以通过c AMP-PKA信号通路有效抑制ROS诱导的蛋白脱磷酸化,从而缓解ROS对精子细胞线粒体电子传递链造成的损伤,保证猪精子体外保存过程中有充足的能量供应,从而维持精子体外保存的运动能力。因此,本研究首次从蛋白脱磷酸化的角度探究了APS、MLT和CNMs通过对抗ROS毒性保护猪精子,并且为探究外源添加抗氧化剂对精子保护作用的分子机制提供了理论参考,证实了使用APS、MLT和CNMs作为猪精液稀释液添加剂的可能性。