维吉尼亚霉素(virginiamycin,简称VGM)是一种由维吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)经发酵产生的内脂环肽类的链阳性抗生素,由多种组分组成的化合物,主要是由巨环内脂类的M1因子和环状多肽类的S1因子构成。VGM因具有结构新颖、安全无毒,不易产生耐药突变株等特点,是一种不可多得的应用前景良好的动物饲料添加剂。目前我国每年大量进口该产品,使用成本较高,因此对维吉尼亚链霉菌进行诱变选育以及开展发酵工艺优化研究具有十分重要的社会效益与经济效益。本课题首先建立了一种高通量筛选方法,即利用24孔板作为诱变菌株的微型培养平台,再结合管碟法和高效液相色谱法(HPLC)作为维吉尼亚霉素检测和筛选方法,以期筛选高产VGM的突变株。管碟法简单方便易于观察,主要用于大量诱变菌株的初筛,可以快速提高筛选效率。HPLC检测方法准确灵敏,因此将其作为VGM的定量检测方法。其次,利用单因素实验确定24微孔板培养体系最佳发酵培养基装液量为1.25mL,最佳接种量为5%,最佳发酵时间为30h,最佳转速为240rpm,通过相关实验发现,采用24孔板的微量培养体系用于大量菌株的快速筛选是可行和有效的,具有明显的优势。本课题以维吉尼亚链霉菌FL3为出发菌株,根据生物合成代谢途径及代谢调控育种的基本理论,运用紫外、微波、亚硝酸钠等多种诱变因子进行菌种选育,并以前体、硫酸链霉素等作为抗性筛选剂,使维吉尼亚链霉菌产VGM的能力不断提高,最终选育出了一株遗传稳定的耐硫酸链霉素的高产菌株MWS178。该菌株的发酵单位为146.72ug/mL,比出发菌株的发酵单位提高了 6倍左右。同时发现基于硫酸链霉素的微波诱变正突变率高达32.83%,更易获得高产VGM的突变菌株。本课题对维吉尼亚链霉菌MWS178发酵培养基以及培养条件进行了优化,通过单因素实验考察了接种量、碳源、氮源等对发酵的影响,得出最佳的发酵培养基(g/L):葡萄糖10,可溶性淀粉10,黄豆饼粉20,酵母浸膏10,NaCl 2.5,pH7。最佳的摇瓶培养条件:种龄16h,接种量5%,装液量为30mL/250mL三角瓶,温度为28℃,发酵48h。基于以上优化后的发酵工艺,菌株MWS178最终产VGM高达460.23ug/mL,较原始发酵工艺条件的发酵单位提高了 3倍多。近年来,有关稀土元素对微生物发酵的影响的报道逐年增加。本课题进一步首次考察了 6种稀土元素对VGM产量的影响。研究结果表明,不同稀土元素对VGM产量产生的效果是不同的,其中发酵前向发酵培养基中添加200mg/L氯化铯或300mg/L硝酸钐或3mg/L氯化锶或10mg/L氯化镧,VGM产量较对照相比分别提高了 13.13%,22.64%,23.91%,32.60%,进一步研究发现氯化镧最佳的添加时间为发酵初期。在发酵初期添加1Omg/L氯化镧,菌株MWS178产量高达610.28ug/mL,比出发菌株FL3产量提高了 28倍左右。