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研究背景急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)作为一种严重威胁人类生命安危的疾病,大多数是冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的结果。ACS治疗方案的选择和预后的评估与冠脉病变严重程度密切相关,但目前对ACS冠脉病变严重性的评估主要依赖于冠状动脉造影(coronary angiography),具有有创、昂贵、风险高、推广难等缺点,亟需能够简单、有效评估冠脉病变严重程度的新型生物标志物。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类具有高遗传稳定性、普遍存在于真核生物体内的内源性单链非编码小RNA,其平均长度仅约22个碱基。miRNA在生命活动中普遍存在并发挥着重要作用,与肿瘤、代谢性疾病、心脑血管病和传染病等多种疾病的发生发展有着密切关系。近期研究显示miRNA有望成为肿瘤、心血管疾病等疾病诊断和评估的生物学标志物。miRNA-221/222是近年来备受瞩目的miRNA家族成员,研究显示miRNA-221/222可通过抑制血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)的增殖、迁移、分化,促进血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的增殖、迁移、去分化发挥促冠状动脉粥样硬化的作用。有研究显示,冠心病(coronary atherosclerotic disease,CAD)患者循环血液中miRNA-221/222水平是升高的。但循环miRNA-221/222与ACS患者冠脉病变严重程度的关系尚缺乏研究。在本研究中,我们应用实时荧光定量PCR 技术(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)分别检测 ACS 患者和对照组循环miRNA-221/222的相对表达水平,明确循环miRNA-221/222与冠状动脉病变严重程度的相关性,探讨循环miRNA-221/222成为ACS发病风险预测的生物学标志物的可行性,并寻找其可能的分子机制,为进一步基础实验及临床应用提供证据。研究目的(1)采用病例对照研究对比ACS患者和对照组循环miRNA-221/222相对表达水平的差别;(2)探讨循环miRNA-221/222与冠状动脉病变严重程度及与ACS发生的相关性;(3)讨论循环miRNA-221/222在预测ACS发病风险中的价值。研究方法本次研究于2016年10月至2017年10月连续收集于山东大学齐鲁医院行冠状动脉造影患者500例,严格按照入选标准及排除标准共筛选出338例受试者,其中ACS患者267例(包括UA患者191例和AMI患者76例),对照组71例。收集受试者一般情况、既往病史、实验室检查、心电图、用药史等资料。于冠状动脉造影术中肝素化前抽取右侧桡动脉或股动脉血液5 ml,采用血浆miRNA提取分离试剂盒提取血浆总RNA,应用RT-qRCR技术并采用外参法获取循环miRNA-221/222的相对表达水平。应用SPSS 19.0、GraphpadPrism 5.0及MedCalc 15.2进行统计学分析。连续变量用平均值±标准差(mean±SD)表示,运用独立样本t检验或非参数秩和检验比较两组间差异,运用单因素方差分析进行多组间比较。分类变量用构成比表示,运用卡方检验比较两组或多组间差异。运用Pearson或Spearman相关分析进行两变量之间的相关性分析。运用多因素线性回归分析循环miRNA-221/222与Gensini评分的线性关系。运用Logistic回归模型分析循环miRNA-221/222与ACS发生的关联性。运用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC curve)评价循环miRNA-221/222对冠状动脉狭窄≥50%的诊断价值。研究结果(l)循环miRNA-221/222相对表达水平的组间比较:与对照组相比,ACS组循环miRNA-221/222相对表达水平均升高,差异均具有统计学意义(P均<0.05);与对照组相比,不稳定型心绞痛(unstableangina,UA)组及急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)组循环miRNA-221/222相对表达水平均升高,差异均具有统计学意义(P均<0.05),但UAA组和AMI组之间循环miRNA-221/222差异无统计学意义(P均＞0.05)。(2)控制混杂因素后循环miRNA-221/222相对表达水平的组间比较:循环miRNA-221 与谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、利尿剂、硝酸酯类、低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)呈正相关(P 均<0.05),与高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、β 受体阻滞剂(β-blocker)、他汀类呈负相关(P均<0.05)。控制上述混杂因素后,与对照组相比,ACS组循环miRNA-221相对表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,UA组循环miRNA-221相对表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05),但对照组与AMI组、UA组与AMI组之间循环miRNA-221差异均无统计学意义(P均>0.05)。循环miRNA-222与高血压史、硝酸酯类、LMWH呈正相关(P均<0.05),与男性、吸烟史、HDL、β-blocker呈负相关(P均<0.05)。控制上述混杂因素后,与对照组相比,ACS组循环miRNA-222相对表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);AMI组循环miRNA-222高于对照组及UA组,差异均具有统计学意义(P均<0.05),但是对照组与UA组之间循环miRNA-222差异无统计学意义(P>0.05)。(3)循环miRNA-221/222相对表达水平与Gensini评分的关系:以Gensini评分为因变量,以临床基线资料、冠心病危险因素、实验室检查、用药史、循环miRNA-221为自变量,进行多元逐步线性回归,年龄、既往心梗史、白细胞(white blood cell,WBC)、氯吡格雷/替格瑞洛、血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)/血管紧张素受体阻滞剂(angiotensinreceptor blocker,ARB)、β-blocker、循环 miRNA-221 进入回归方程,循环 miRNA-221(β=0.100,P=0.041)与Gensini评分呈正性线性相关。以Gensini评分为因变量,以临床基线资料、冠心病危险因素、实验室检查、用药史、循环miRNA-222为自变量,进行多元逐步线性回归,年龄、WBC、氯吡格雷/替格瑞洛、ACEI/ARB、β-blocker、循环 miRNA-222 进入回归方程,循环 miRNA-222(β=0.100,P=0.047)与Gensini评分呈正性线性相关。(4)循环miRNA-221/222相对表达水平与疾病发生的关系:①ACS危险因素Logistic回归模型:以ACS作为因变量,以性别、年龄、收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP)、吸烟史、高血压史、糖尿病史、冠心病家族史、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、HDL、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、循环 miRNA-221 等作为自变量,进行多因素逐步Logistic回归分析,循环miRNA-221进入回归方程,表明循环miRNA-221为ACS发病的危险因素(OR值1.159,95%CI:1.033-1.299,P=0.012);以ACS作为因变量,以性别、年龄、SBP、DBP、吸烟史、高血压史、糖尿病史、冠心病家族史、TC、TG、HDL、LDL、FBG、Hcy、循环miRNA-222等作为自变量,进行多因素逐步Logistic回归分析,循环miRNA-222进入回归方程,表明循环miRNA-222为ACS发病的危险因素(OR值1.132,95%CI:1.024-1.251,P=0.015)。②UA 及 AMI 危险因素 Logistic 回归模型:以 UA 及 AMI作为因变量,以性别、年龄、SBP、DBP、吸烟史、高血压史、糖尿病史、冠心病家族史、TC、TG、HDL、LDL、FBG、Hcy、循环miRNA-221等作为自变量,进行多因素逐步Logistic回归分析,循环miRNA-221进入回归方程,表明循环miRNA-221 既是 UA 发病的危险因素(OR 值 1.154,95%CI:1.031-1.290,P=0.012),也是 AMI 发病的危险因素(OR 值 1.153,95%CI:1.030-1.290,P=0.013);以UA及AMI作为因变量,以性别、年龄、SBP、DBP、吸烟史、高血压史、糖尿病史、冠心病家族史、TC、TG、HDL、LDL、FBG、Hey、循环miRNA-222等作为自变量,进行多因素逐步Logistic回归分析,循环miRNA-222进入回归方程,表明循环miRNA-222既是UA发病的危险因素(OR值1.120,95%CI:1.018-1.232,P=0.020),也是 AMI 发病的危险因素(OR 值 1.132,95%CI:1.028-1.245,P==0.011。(5)循环miRNA-221/222相对表达水平诊断冠状动脉狭窄≥50%的价值:绘制ROC曲线,获取循环miRNA-221/222诊断冠状动脉狭窄程度≥50%的曲线下面积(area under curve,AUC),分析循环 miRNA-221、miRNA-222 的 AUC 及95%可信区间(confidence interval,CI)分别为 0.605(0.550-0.657)、0.643(0.589-0.694),具有一定的诊断价值。研究结论(1)ACS患者循环miRNA-221/222相对表达水平均显著升高;(2)循环miRNA-221/222相对表达水平与冠状动脉病变严重程度呈正相关;(3)循环miRNA-221/222是ACS发生的危险因素,有可能成为ACS发病风险预测的生物学标志物;(4)循环miRNA-221/222有望成为诊断冠状动脉狭窄≥50%的新型生物学标志物。