研究背景：结直肠癌是常见的恶性肿瘤,在我国总的发病率可排在第三,死亡率排在第五。结直肠癌有一个特征性的病理变化过程,大部分的结直肠癌被认为起源于良性的结直肠腺瘤。对结直肠癌早期阶段,也就是腺瘤进行基因组层面的研究将帮助我们更深入的了解肿瘤的发生,不但有助于我们找到肿瘤早期阶段的分子标志,可能可以用来预测腺瘤和癌的发生；也可以帮助我们进一步理解肿瘤早期阶段的分子信号通路,用来阻断和预防肿瘤的发生。在肿瘤基因组中,不光是编码基因推动了肿瘤的发生和发展,非编码基因如micro Ribonucleic acid (miRNA)也在肿瘤的发生发展中有重要作用。二代测序技术是近年发展起来的新技术,极大地推动了肿瘤基因组学的发展。在本课题中,我们用二代测序技术对腺瘤的全外显子以及miRNA进行测序,用来寻找可以预测腺癌发生的分子标志,以及帮助理解发生在肿瘤早期阶段的信号通路。实验方法：一、我们对来自同一例Ⅱ期结直肠癌病人的正常肠粘膜、腺瘤和腺癌组织使用NimbleGen2.1M Human Exome Array捕获芯片进行外显子捕获,接着使用Illumina GAⅡ测序仪进行了测序。以正常肠粘膜作为对照,研究腺瘤和腺癌中的体细胞突变；在同一基因背景下,比较腺瘤和腺癌在基因组学上的差别。在使用SAMtools找出腺瘤和腺癌中的突变后,筛除非编码区的突变、SNP以及同义突变,获得腺瘤和腺癌中的非同义的体细胞突变。二、将在第一部分研究中找到的突变在73个腺瘤和288个腺癌中进行验证；并收集整理肠癌肠癌常见的突变和常见的功能通路,共整理133个肠癌相关的突变基因,在40例腺瘤中进行捕获测序,筛查在腺瘤中的常见突变基因和通路。使用的软件和流程和第一部分相同。三、在3对正常粘膜、腺瘤和腺癌中进行miRNA的平行测序,用来筛查发生在结直肠癌早期的异常表达或序列改变的miRNA。将测序获得的序列与miRNA数据库进行比对,得到各个组织中的miRNA表达量,标准化后在各个配对样本之间比较,找出表达差异的miRNA。那些没有比对到miRNA数据库上的序列,与miRBase数据库中已知成熟miRNA序列进行比对(只允许在特定位点的错配,即“种子序列”2到8号碱基)来找出发生了碱基突变的miRNA。实验结果：一、在腺瘤中,我们发现了12个体细胞突变,在腺癌中,有42个体细胞突变。腺瘤和腺癌中的碱基变化特征接近。在我们发现的突变中,其中的大部分突变比如OR6X1, SLC15A3, KRTHB4, RBFOX1, LAMA3, CDH20, BIRC6, NMBR, GLCCI1, EFR3A,和FTHL17在结肠腺瘤中是第一次被报道。对这些突变进行功能分析,发现Wnt通路,细胞黏附通路和泛素介导的蛋白降解通路同时发生在腺瘤和腺癌中。如细胞黏附通路的CDH20和LAMA3在腺瘤中突变,而NRXN3和COL4A6在腺癌中突变。二、APC基因在腺瘤中突变频率接近50%。细胞黏附通路相关的蛋白在40个腺瘤中有3个腺瘤发生了突变,相当于约8%的突变频率。泛素介导的蛋白降解通路相关的蛋白在40个腺瘤中有7个腺瘤发生了突变,相当于17.5%的突变频率。除了這2个通路外,DNA错误修复基因发生突变的频率也较高。在40个腺瘤中有4个腺瘤包含错配修复基因的突变,相当于10%的突变频率。三、hsa-miR-135b*、hsa-miR-31和hsa-miR-503在肠癌中高表达,而在腺瘤也出现高表达；miR-9和miR-195在肠癌中低表达,而在腺瘤中也出现了低表达,提示这些miRNA的异常表达和对编码基因的调控出现在腺瘤阶段。miRNA在腺瘤和腺癌中都存在序列变异,比如miR-376a-2、miR-381、miR-411、miR-503和miR-585存在SNP,而miR-625、miR-1974、miR-376c和miR-144存在体细胞突变,且都出现在在结直肠癌的早期阶段。实验结论：腺瘤和腺癌的基因组学特征接近,也有类似数目的体细胞突变,但比配对的癌要少。WNT,细胞黏附、泛素介导的蛋白水解通路和DNA错误修复基因于腺瘤阶段发生突变并推动了肿瘤的发展。WNT通路的突变主要集中在APC基因上,而其他几个通路的由多个低频的突变组成。多个miRNA在腺瘤中存在异常表达和序列变异。因此,腺瘤和腺癌的外显子和miRNA的比较测序为我们对结直肠癌的早期分子事件提供了新的认识。