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隐孢子虫病是6种世界最常见腹泻病之一,该病分布广泛、危害严重,对免疫缺陷病人(如HIV患者)可以引起致死性的腹泻。微小隐孢子虫(Cryptosporidum parvum)子孢子表面粘附蛋白gp60是微小隐孢子虫子孢子表面的主要抗原,2000年由Cevallos等和Strong等三个研究团队同时发现并报道,是特异性预防、治疗隐孢子虫感染的有效靶抗原。揭示gp60蛋白在微小隐孢子虫入侵宿主细胞过程中的相关生物学功能,对研究微小隐孢子虫的入侵机制具有重要意义。本研究首先根据微小隐孢子虫gp60和gp40基因序列设计引物,PCR扩增得到的目的基因片段gp60和gp40,大小分别为885 bp和570 bp。目的片段回收后,将其与克隆载体pMD18-T连接,并对重组克隆质粒进行测序,结果正确后将目的片段连接至表达载体pGEX-4T-1,然后对重组表达载体进行酶切鉴定及测序。重组表达质粒构建完成后进行原核表达、SDS-PAGE和Western blot检测鉴定,结果显示重组表达的gp60-GST-His和gp40-GST-his蛋白大小均符合预期。重组蛋白经过GST和His双标签纯化后,得到高纯度的gp60-His-GST与gp40-His-GST浓度分别为1.96 mg/mL、1.99 mg/mL,可用于后续实验。将得到的重组蛋白作为抗原分别对家兔进行免疫后制备抗血清,终放血后ELISA检测抗血清效价为1:32000;用Protein A法对抗血清进行纯化,得到的多克隆抗体重链43-55 KDa左右,轻链在25 KDa左右,anti-gp60和anti-gp40的IgG浓度分别为2.15 mg/mL、1.97 mg/mL;利用间接免疫荧光的方法对重组蛋白进行亚细胞定位发现,gp60蛋白被定位在裂殖子表面,而gp40蛋白被定位在子孢子表面;用RT-PCR方法检测子孢子入侵宿主细胞不同时间gp60与gp40蛋白的表达量发现,gp60与gp40蛋白表达量12 h达到最大值,也就是隐孢子虫入侵宿主细胞的早期发育阶段;并且在24 h和48 h也维持在一个很高的表达量,也就是在发育成裂殖子、形成大小配子体以及形成合子阶段。由此我们推断,gp60蛋白可能在隐孢子虫入侵宿主细胞后的整个发育阶段都发挥着重要的作用,特别是裂殖生殖阶段;具体的生物学功能还有待进一步的研究和论证。将纯化出的重组gp60和gp40蛋白多克隆抗体分别按0μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml与微小隐孢子虫子孢子进行孵育后,RT-PCR检测不同抗体浓度对微小隐孢子虫入侵率的影响。结果显示,与正常入侵组相比,低浓度的抗体阻断就使微小隐孢子虫的入侵率有明显下降。由此说明,阻断gp60与gp40蛋白可以使微小隐孢子虫对宿主细胞的入侵率降低。综合上述结果证明gp60蛋白在微小隐孢子虫粘附、入侵宿主细胞的过程中发挥了重要的作用,能够识别gp60蛋白的多抗具有阻断微小隐孢子虫入侵宿主细胞的能力。