好氧高温堆肥是一种经济、环保的农业固体有机废弃物资源化利用的手段。高温堆肥过程中的物质变化与腐熟度评价以及微生物多样性的研究一直以来都是国内外关注的热点,它们与堆肥产品的质量和堆肥发生的机理密切相关,对堆肥的生产具有指导意义。但是,文献报道的大多数堆肥腐熟度的评价指标测定起来比较复杂,不利于中小型堆肥企业的实际应用。另外,对于堆肥过程中微生物多样性的研究更多的是以实验室规模的小型发酵试验为主,而对于企业应用较多的传统条垛堆肥发酵关注较少,并且分析方法也有一定的缺陷。因此,本文以牛粪和水稻秸秆为原料进行了高温条垛堆肥的发酵,对堆肥过程中的物质变化与腐熟度评价以及微生物多样性进行了研究,主要研究结果如下：1.通过对堆肥过程中的部分物理指标、化学指标和生物指标的研究表明整个堆肥过程可以明显的分为升温(0-12天)、高温(22-52天)和降温腐熟(62-112天)三个不同的阶段,有机物质的降解和水分的蒸发等主要发生在堆肥的升温和高温阶段(0-52天),而硝化作用和腐殖化作用主要发生在堆肥的降温和腐熟阶段。以测得的各种理化指标进行腐熟度评价发现单个指标并不能很好的评估堆肥的腐熟程度,必须两个或两个以上的指标相结合。以发芽指数(GI)为标准进行相关性分析表明C/N、OM损失和NH4+-N/NO3-N是更为可靠的牛粪堆肥腐熟度的评价指标；各指标综合评价表明以牛粪和水稻秸秆为原料的堆肥62天以后已经达到腐熟。2.三维荧光光谱与荧光区域指数(EEM-FRI)的研究结果表明在牛粪高温堆肥过程中,蛋白质的含量逐渐低,而腐殖酸和富里酸的含量则逐渐上升；通过EEM-FRI与堆肥过程中的理化指标以及生物指标的相关性分析确定,EEM-FRI与大部分常用的评价堆肥腐熟度的理化指标都显著相关,因此可以用于评价牛粪堆肥的腐熟度,并且具有简单、快速的特点。红外光谱的分析结果则显示随着堆肥的进行,不同时期堆肥样品的红外光谱的峰所在的区域变化不大,只是峰的强度变化较大。3.分别对五种不同的堆肥DNA提取方法进行了细胞破壁效率、DNA和腐殖酸产量、PCR扩增和微生物多样性等方面的比较,建立了一种适合以牛粪和水稻秸秆为原料的堆肥样品的DNA提取和纯化方法FTSPP. FTSPP法的细胞破壁效率达到了94.6%,纯DNA的产量达到了33.19μg/g dw,并且在1μg/μ1牛血清白蛋白(BSA)存在的条件下成功的进行了PCR扩增,并且通过荧光定量PCR和DGGE分析表明,FTSPP法提取的DNA获得的细菌和放线菌的16S rRNA的拷贝数以及DGGE条带数均高于其他方法。4.通过平板培养技术对牛粪高温堆肥过程中的常温(30℃)和高温(55℃)微生物的数量进行了研究,结果表明无论常温还是高温可培养微生物的数量在堆肥过程中均经历了一个先增加再降低然后再增加的变化趋势,常温细菌和放线菌的数量在第22天达到最大值,分别为9.331g CFU/gdw和7.181g CFU/gdw,而常温真菌则在第12天达到最大值,为5.121g CFU/g dw;高温细菌和放线菌数量最大值出现的时间比常温微生物明显滞后,均在第32天获得最大值,1g CFU/g dw分别为7.17和5.78,而高温真菌在第22天达到最大值,1gCFU/g dw为3.24。根据DGGE的研究结果可将整个堆肥过程分为0-12天、22-52天和62-112天三个与根据温度划分相一致的阶段,在堆肥前期(0-12天)微生物种类变化最剧烈,但总体呈现先上升再下降最后再上升的变化趋势,并且高温阶段的样品与降温腐熟阶段的样品的相似性要高于升温阶段的样品。成功测序的DGGE条带的序列比对结果显示,Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria和Actinobacteria是堆肥过程中主要的微生物门类,条带M和条带X均与Bacillus属微生物表现出了较高相似性(99%),条带S则与Streptomyces sp.(EF012138)表现出了100%的序列相似性,另外,大部分为未培养的微生物。根据FRI参数与堆肥过程中细菌的种类变化的相关性分析发现PⅡ,n和PⅣ,n与堆肥过程中细菌的种类变化的相关系数分别达到了0.907和0.949,进一步的线性回归分析证明PⅣ,n是更可靠地评价以牛粪和水稻秸秆为原料的堆肥过程中细菌种类变化的参数。分别对0、12、42和112天的堆肥样品进行了16S rRNA基因克隆丈库的构建和序列分析,成功测序的779个克隆的Genebank登陆号为JQ336994-JQ337772.多样性分析表明四个时间段的Shannon-Wienner指数分别为2.64、3.25、3.18和4.05。序列分析显示Frimicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi门的微生物在堆肥过程中普遍存在,而Actinobacteria则只存在于堆肥的高温阶段(42天),并且第一次在堆肥后期样品中(112天)发现了BCR1门的微生物。Arthrobacter属的克隆数在高温阶段的样品中(42天)含量最高,达到了21.74%；而Bacillus和Bacillus相关的属包括Soilbacillus, Aneurinibacillus, Marinibacillus和Ureibacillus的相对含量为8.70%,在第112天更是达到了10.25%；另外,第112天的样品中,伴随着新的属包括Flavobacterium, Parapedobacter, Nitrosomonas, Ochrobactrum和Rhizobium的出现；所有文库中有相当一部分序列属于未分类微生物,并且随着堆肥的进行它们所占的比例越来越高。5.从第82天的新鲜堆肥样品中经过富集、初筛和复筛成功的分离到两株具有较高纤维素酶活的细菌菌株T1和T2,结合生理生化和16S rRNA基因序列分析分别鉴定为Bacillus cereus和Bacillus subtilis.根据NCBI报道的Bacillus subtilis葡聚糖内切酶基因设计引物,克隆到Bacillus subtilis T2的葡聚糖内切酶基因,与报道的内切酶基因均具有99%的相似性,以PET28a为表达载体构建了重组质粒,以E. coli BL21(DE3)为表达菌株,成功的表达了Bacillus subtilis T2的葡聚糖内切酶基因,且在粗酶液检测到了较高的内切酶活性。