凡纳滨对虾甲基法尼酯结合蛋白的发现及其功能研究

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甲基法尼酯(Methylene farnesoate,MF)是存在于甲壳动物体内一种十分重要的内分泌倍半萜类激素,其主要作用包括调控甲壳动物蜕皮、生长发育与繁殖等过程。然而,在甲壳动物中,甲基法尼酯如何运输到靶器官从而发挥作用尚未清晰。本研究以凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei为研究对象,通过生物信息学整合凡纳滨对虾基因组与转录组的数据信息,筛选到了11个Juvenile hormone binding protein结构域(JHBP-domain)基因,对这些JHBP-domain基因分析并克隆了表达量最高的一个基因(XP027209752.1)。利用原位杂交、免疫荧光组化以及Western blot等实验,从mRNA以及蛋白水平研究XP027209752.1的表达模式。通过等温滴定量热实验与表面等离子共振实验研究XP027209752.1蛋白与不同激素之间的亲和能力,发现预测的XP027209752.1蛋白尽管含有JHBP结构域,但是与JH Ⅲ并没有亲和力,而是结合甲基法尼酯,因此该XP027209752.1蛋白可以被命名为甲基法尼酯结合蛋白(Methylene farnesoate binding protein,MFBP)。最后利用激素测定与RNA干扰验证了MFBP对甲基法尼酯具有保护作用,并且可以抑制凡纳滨对虾蜕皮。本研究阐明了甲基法尼酯在甲壳动物中的运输模式及MFBP在对虾蜕皮过程中的作用,完善了对虾的蜕皮通路,为其他甲壳动物的蜕皮研究提供理论基础。1.JHBP-domain基因筛选与分析利用生物信息学手段对凡纳滨对虾与不同物种基因组进行注释,并筛选出JHBP-domain基因。对凡纳滨对虾11个JHBP-domain基因进行结构域预测与表达量分析。选取表达量最高的XP027209752.1基因,利用RACE技术获得了其全长cDNA序列。2.XP027209752.1表达模式分析构建XP027209752.1基因重组表达载体,表达并纯化了XP027209752.1蛋白,并作为抗原注射至兔体内制备并纯化了该蛋白抗体。通过原位杂交、免疫荧光组化以及Western blot等实验发现XP027209752.1在凡纳滨对虾肝胰腺中表达并会运输到血淋巴中。3.XP027209752.1蛋白亲和力测定选取保幼激素合成通路上的法尼醇、法尼酸、甲基法尼酯、保幼激素Ⅲ以及保幼激素类似物烯虫丙酯等激素,通过等温滴定量热实验以及表面等离子共振实验发现XP027209752.1蛋白与甲基法尼酯亲和力较高,而与保幼激素Ⅲ并没有亲和力。因此,将XP027209752.1蛋白命名为甲基法尼酯结合蛋白(MFBP)。4.甲基法尼酯结合蛋白(MFBP)的功能分析为了进一步研究MFBP的功能,通过激素测定实验与RNA干扰技术,发现MFBP可以保护甲基法尼酯,并抑制转化为法尼酸。而且也发现在注射MFBP mRNA的dsRNA后,发现凡纳滨对虾蜕皮加速,表明MFBP通过运输甲基法尼酯而抑制凡纳滨对虾蜕皮。
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