研究背景铁是人体必需的微量元素之一,参与机体多种生理生化过程,包括氧气运输、DNA合成、电子传递等。以往的研究主要集中在缺铁性贫血,近年来,研究者发现铁过负荷同样对机体具有严重危害。肝脏是调控机体铁稳态的主要器官,许多疾病伴有不同程度的肝铁沉积,例如β-地中海性贫血(β-Thalassemia),该病患者由于反复输血导致肝脏铁沉积(又称输入性铁过负荷),同时可见血清丙二醛(malonyldialdehyde, MDA)含量、炎性因子和转氨酶升高。大量研究证实,铁通过催化Fenton反应产生活性氧(Reactive oxidative species, ROS),损害脂质、蛋白、核酸,造成氧化应激损伤,进而激活巨噬细胞导致炎症反应。近年来有研究报道,miR-122和miR-146a的表达变化在炎症反应中具有重要作用。有意义的是,本课题组前期研究发现,肝脏铁过负荷除了可以引起肝脏组织细胞氧化应激损伤之外,还可以抑制肝细胞核转录因子4a (Hepatocyte nuclear factor 4a, HNF4a)和miR-122和miR-146a表达,进而激活NF-κB信号通路,引起炎症反应。Vit.E (Vitamin E, Vit.E)作为一种广泛应用的抗氧化维生素,可清除体内多余的ROS,维持机体氧化与抗氧化系统的平衡。有研究报道,Vit.E补充可降低铁过负荷导致的氧化应激。但是,另有研究报道,过量的Vit.E补充可加重铁过负荷氧化应激状态。Vit.E对铁过负荷氧化应激的影响存在争议。已知,临床采用Vit.E防治地中海贫血患者红细胞氧化损伤,其是否可以防治铁过负荷引起的肝脏组织细胞氧化应激损伤以及炎症反应未见报道。研究目的本课题通过动物和细胞实验,观察Vit.E补充对铁过负荷肝脏组织细胞氧化应激和炎症反应的影响,为今后临床上是否采用Vit.E补充这一方法防治铁过负荷肝脏损伤相关疾病提供实验依据。研究方法一、动物分组与处理24只雄性4周龄C57BL/6小鼠,按体重随机分组：对照组(Ctrl)、铁过负荷(IO)组、铁过负荷+玉米油(IO+corn oil)组、铁过负荷+Vit.E (IO+Vit.E)组,每组6只。对照组腹腔注射0.9%生理盐水,其余三组腹腔注射右旋糖酐铁(20 mg/ml),每次0.15ml,每周2次,共2周,总铁量12 mg。IO+Vit.E组小鼠每天灌胃溶于玉米油的Vit.E(100 mg/kg·bw), IO+corn oil组小鼠每天灌胃与Vit.E等体积的玉米油,共2周,IO+corn oil作为溶剂对照组。二、部分血清生化参数和肝铁含量的检测采用全自动血生化仪检测各组小鼠血清中血清铁(SI)、转铁蛋白饱和度(TS)、总铁结合力(TIBC)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)等参数。硝化法测肝铁含量。肝脏普鲁士蓝染色观察肝铁沉积情况。三、肝脏氧化应激指标的检测ROS含量测定：制备小鼠肝脏组织匀浆液,离心吸取上清液,用ROS检测探针DCF 37℃避光孵育1 h (DCF终浓度为5μM),酶标仪检测荧光强度。丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)含量检测：肝脏组织匀浆处理,然后按说明书操作进行。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG):采用免疫荧光方法,操作按照说明书进行。四、肝脏HE染色及炎症病理评分肝脏组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。摊片,厚度为4μm,然后用苏木精和伊红染色。显微镜下观察并拍照,按照1985年lok.Schener评价慢性肝炎合并HDV感染方法进行炎症病理评分。五、细胞培养与处理人肝癌细胞株Huh7细胞分为对照组、Holo-Tf组(Holo-transferrin)和Holo-Tf+Vit.E组。Holo-Tf组加入Holo-Tf(终浓度为30 μM),Holo-Tf+Vit.E组同时加入Holo-Tf(终浓度为30μM)和Vit.E(终浓度为50 μM),对照组加入无菌RNase Free ddH2O,干预时间为24h。细胞羟自由基(·OH)含量、SOD活性、MDA含量、GSH含量的检测：细胞用添加Holo-Tf和Vit.E的培养液培养后,制备肝细胞悬液,然后按说明书操作进行。六、实时定量荧光PCR用Trizol裂解组织或者细胞,按比例加入氯仿进行萃取。离心取上层水相,用异丙醇沉淀RNA。75%乙醇将沉淀洗2遍,得到的白色絮状沉淀即为RNA。加入20μl左右RNase Free ddH2O溶解。测RNA浓度,再将RNA反转录成cDNA。按照目的基因的正反引物及内参基因正反引物,SYBR Green, cDNA, DEPC水进行实时定量荧光聚合酶链式反应。动物内参为18S,细胞内参为β-actin。根据扩增得到的Ct值计算RQ值,并进行统计分析。七、Western blot肝脏组织或细胞加入蛋白裂解液(lysis buffer:蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂：PMSF体积比为1 ml:1 μl:10 μl:5 μl)。经匀浆、裂解、离心后,吸取蛋白上清液,然后上清液和loading buffer按4：1比例进行蛋白变性。用BCA试剂盒定量。蛋白经电泳、转膜,封闭,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,加显影液显蛋白条带,条带进行灰度分析,最终统计分析不同蛋白的表达情况。八、统计和分析数据用x±s表示,用SPSS 21.0软件分析。多组间比较采用方差分析。以P<0.05,P<0.01,P<0.001表示差异有统计学意义。结果一、Vit.E对铁过负荷小鼠和Huh7细胞铁状态的影响1.小鼠的一般情况IO组与对照组比较,小鼠体重和进食量无差异。IO+Vit.E与IO+corn oil组比较,小鼠体重和进食量无差异。IO+Vit.E与IO+corn oil组小鼠的体重和进食量低于对照组。2.小鼠的铁负荷状态(1)小鼠血清铁相关参数和肝铁含量与对照组比较,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠SI、TS、肝铁含量均显著升高。给铁的同时给予Vit.E补充后,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠之间SI、TS、肝铁含量无显著性差异。与对照组比较,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠肝脏普鲁士蓝染色均可见明显铁沉积。(2)小鼠肝脏铁代谢调节分子的表达变化与对照组比较,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠肝脏FTL1, HAMP mRNA和蛋白表达显著升高,TFRC mRNA和蛋白表达显著降低。而给铁的同时给予Vit.E补充后,IO、IO+corn oil和IO+Vit.E组小鼠之间肝脏FTL1, TFRC, HAMP mRNA和蛋白表达无显著性差异。3.铁过负荷Huh7细胞铁代谢调节分子表达变化与对照组比较,在添加30 μM Holo-Tf的细胞培养液中暴露24h, Huh7田胞铁代谢调节分子FTL1, HAMP mRNA和蛋白表达升高,TFRC mRNA和蛋白表达降低。与单纯Holo-Tf组相比,在添加30 μM Holo-Tf同时添加50 μM Vit.E的细胞培养液中暴露24h, Huh7细胞铁代谢调节分子FTL1, HAMP, TFRC mRNA和蛋白表达无显著性差异。二、Vit.E对铁过负荷肝脏组织细胞氧化应激的影响(一)Vit.E对铁过负荷小鼠肝脏组织氧化应激的影响1. Vit.E对铁过负荷小鼠肝脏ROS、MDA、GSH含量和SOD活性的影响与对照组比较,IO、IO+corn oil组肝脏ROS和MDA含量升高,而SOD活性和GSH含量降低。与IO组比较,I0+Vit.E组肝脏ROS和MDA含量降低,而SOD活性和GSH含量升高。2. Vit.E对铁过负荷小鼠肝脏8-OHdG含量的影响与对照组比较,IO、IO+corn oil组肝脏8-OHdG荧光强度增强。与IO组比较,IO+Vit.E组肝脏8-OHdG荧光强度减弱。(二)Vit.E对铁过负荷Huh7细胞氧化应激的影响1. Vit.E对铁过负荷Huh7细胞·OH含量的影响与对照组相比,在添加30 μM Holo-Tf的细胞培养液中暴露24h, Huh7细胞内·OH显著升高；与单纯Holo-Tf组相比,在添加30 μM Holo-Tf同时分别添加0,25,50,100 μM Vit.E的细胞培养液中暴露24h, Huh7细胞内·OH含量呈现不同程度的降低,有一定的量效关系,但50μM组与100μM的·OH含量没有明显差异。2. Vit.E对铁过负荷Huh7细胞MDA、GSH含量和SOD活性的影响与对照组相比,在添加30 μM Holo-Tf的细胞培养液中暴露24h,Huh7细胞MDA含量升高,SOD活性和GSH含量降低。与单纯Holo-Tf组相比,在添加30 μM Holo-Tf同时添加50 μM Vit.E的细胞培养液中暴露24h, Huh7细胞MDA含量有所降低,SOD活性和GSH含量有所升高。三、Vit.E对铁过负荷肝脏组织细胞炎症反应的影响(一)Vit.E对铁过负荷小鼠肝脏组织炎症反应的影响1. Vit.E对铁过负荷小鼠肝脏炎性因子表达的影响与对照组比较,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠肝脏p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表达均升高。与IO组比较,IO+corn oil、IO+Vit.E组之间小鼠肝脏p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表达无显著性差异。2. Vit.E对铁过负荷小鼠肝脏炎症评分的影响与对照组比较,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠肝脏HE染色病理切片的炎症评分均显著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠之间肝脏炎症评分无显著性差异。3. Vit.E对铁过负荷小鼠血清AST、ALT水平的影响与对照组比较,IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠血清AST、ALT水平均显著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E组小鼠之间血清AST、ALT水平无显著性差异。(二)Vit.E对铁过负荷Huh7细胞炎性因子表达的影响与对照组相比,在添加30 μM Holo-Tf的细胞培养液中暴露24h, Huh7细胞炎性因子p65, TNFα, IL-6 mRNA和蛋白表达均显著升高。与单纯Holo-Tf组相比,在添加30 μM Holo-Tf同时添加50 μM Vit.E的细胞培养液中暴露24h,Huh7细胞p65,TNFα,IL-6 mRNA和蛋白的表达无显著性差异。(三)Vit.E对铁过负荷Huh7细胞HNF4α, miR-122, miR-146a, CCL2, TRAF6表达的影响在添加30 μM Holo-Tf的细胞培养液中暴露24h,Huh7细胞HNF4α, miR-122, miR-146a表达显著下调,miR-122和niR-146a的靶基因CCL2,TRAF6表达显著升高。与单纯Holo-Tf组相比,在添加30 μM Holo-Tf同时添加50 μM Vit.E的细胞培养液中暴露24h, Huh7细胞HNF4α, miR-122, miR-146a, CCL2, TRAF6表达无显著性差异。结论综合本课题的研究结果,表明,铁过负荷可引起肝脏组织细胞氧化应激损伤和炎症反应；Vit.E补充可以缓解铁过负荷引起的肝脏组织细胞氧化应激,但不能缓解铁过负荷引起的肝脏组织细胞炎症反应。Vit.E补充对铁过负荷肝细胞HNF4α及miR-122,miR-146a表达下降,NF-κB信号通路活性增强没有明显影响。因此,采用Vit.E补充防治铁过负荷肝脏损伤相关疾病还需要进一步深入研究。