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背景:黄体功能不全是不孕症、早期妊娠流产和复发性流产的直接、重要原因。目前临床治疗效果欠佳。导师应用补肾助孕方治疗“肾阳偏虚,夹有肝郁”的LPD患者取得良好疗效。前期研究已阐明该方对子宫内膜容受性、卵巢内分泌功能的疗效,整体动物实验证实补肾助孕方可矫治LPD模型大鼠垂体促性腺激素异常分泌,但确切机制尚不明了。目的:应用网络药理学方法联合质谱分析技术探讨补肾助孕方的化学组分,该方潜在作用机制,为下一步研究指明方向。本研究着眼于补肾助孕方对垂体的调节作用,从细胞层面研究补肾助孕方对垂体前叶促性腺激素细胞分泌的调控作用,力求阐明补肾助孕方治疗LPD性不孕症的作用机制。方法:(1)应用网络药理学方法,结合权威生物信息数据库分析补肾助孕方中草本来源药物的化学组成及其潜在治疗靶点与涉及的信号通路,同时采用Nano LTQ-Orbitrap技术分析鹿角片水提液中多肽成分,共同探讨补肾助孕方作用机制。(2)西曲瑞克为造模剂,应用补肾助孕方含药脑脊液干预原代腺垂体细胞,Elisa法检测细胞上清液中FSH β、LHβ表达,蛋白印迹法结合qPCR检测GnRHR、各转录子及囊泡转运蛋白的mRNA、蛋白表达,免疫荧光/激光共聚焦技术检测磷酸化CREB及Egr-1在细胞核表达。(3)采用原代腺垂体细胞,使用阻断剂W-7、SQ22536、GO6976干预PKC-MAPK、Ca2+-CAM、cAMP-PKA信号通路,蛋白印迹法结合qPCR检测三条信号通路中节点蛋白表达情况。结果:(1)网络药理学分析共检索得到化合物766种,靶标基因152个,涉及148条信号通路。(2)采用Nano LTQ-Orbitrap技术分析鹿角片水提液中多肽成分,发现传统水煎剂中富含大量寡肽成分,经比对共鉴定出413个肽段,来自于35个蛋白。(3)正向细胞试验中Elisa检测细胞上清液,模型组FSH、LH的β亚基表达显著下调,补肾助孕方含药脑脊液干预后FSH、LH的β亚基表达显著上调;蛋白印迹实验提示模型组GnRHR及转录子AP1、ELK1、Egr-1、CREB、Nur77的蛋白及mRNA显著下调,补肾助孕方含药脑脊液组干预后GnRHR及转录子蛋白及mRNA较组显著改善。(4)西曲瑞克组细胞囊泡转运相关蛋白SNAP-25、Munc18-1的表达显著下调,补肾助孕方含药脑脊液组SNAP-25、Munc18-1的表达较西曲瑞克组显著改善。(5)反向细胞实验中阻断剂显著下调cAMP、PKA、CAM、CAMK2、calcineurin、PKC、ERK1/2、SRC、p38MAPK、JNK的表达,补肾助孕方含药脑脊液干预后,各节点蛋白及mRNA表达显著上调。结论:(1)网络药理学分析发现补肾助孕方参与的信号通路涉及广泛的人体生理病理过程,如调节卵母细胞减数分裂通路、卵巢甾体发生通路、孕酮介导的卵母细胞成熟信号通路、雌激素信号通路、钙信号通路、MAPK信号传导途径、谷氨酸能突触通路等;采用Nano LTQ-Orbitrap技术分析鹿角片水提液中多肽成分,发现传统水煎剂中富含大量寡肽成分,经比对共鉴定出413个肽段,来自于35个蛋白,提示鹿角片温补肾阳治疗LPD的作用机制可能为水提剂中多肽成分,尤其是分子量<3000D的低分子寡肽。(2)实验证明补肾助孕方含药脑脊液可直接调控促性腺激素细胞表面GnRHR进而干预其后信号通路中的cAMP-PKA通路、PKC-MAPK通路、Ca2+-CAM通路,并对下游的转录子AP1、ELK1、Egr-1、CREB、Nur77的转录表达起到调节作用,尤其是对关键转录子Egr-1、CREB的调节,影响促性腺激素的分泌。应用信号通路节点蛋白抑制剂发现补肾助孕方不仅可以直接作用于GnRHR环节,还可作用于PKC、CAM、cAMP等环节,调控垂体的促性腺激素分泌从而发挥其治疗LPD的作用。(3)细胞囊泡转运相关蛋白SNAP-25、Munc18-1的研究发现,补肾助孕方不仅可以改善R1200细胞LPD模型的促性腺激素合成环节,同样改善囊泡的调节性和组成性分泌环节,发挥其治疗LPD的作用。