糖不仅是生命体重要的结构组分和能量来源,而且在生命过程中扮演着十分重要的角色。其中,糖抗原和糖抗体与细菌感染、细胞癌变等一系列疾病的病理过程密切相关。研究疾病相关糖抗原和糖抗体,对疾病的诊断、分析和治疗具有非常重要的意义。因此,本论文针对疾病相关糖抗原和糖抗体进行了制备、分析及免疫学应用。具体来说,本论文分为三部分研究内容:第一部分是针对异种糖抗原L-Rha的抗体的制备和分析;第二部分是L-Rha修饰的黑色素瘤抗原的制备和免疫学应用;第三部分是DNA编码糖抗原文库的制备和应用。第一部分L-鼠李糖抗体的特异性和杀菌活性研究L-鼠李糖（L-Rha）广泛存在于植物和细菌中。细菌中,L-Rha通常与其它糖类或脂类相连形成荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）或糖脂（glycolipid）。人体内不存在L-Rha的生物合成途径。L-Rha作为异种糖抗原,人血清中存在非常高的针对L-Rha的天然糖抗体。尽管人们普遍认为天然糖抗体在清除病原菌方面发挥着重要作用,但是具体到L-Rha抗体,还没有专门和深入的研究报道。本部分中,我们对L-Rha抗体的特异性和杀菌活性进行了探讨。此外,我们分析了L-Rha在细菌血清型中的分布和细菌不同血清型发病率之间的关系。具体来说,首先,我们从健康人血清中纯化了 L-Rha抗体（包含IgG和IgM,且主要是IgG）。此外,我们从人脐血血清中纯化了抗L-Rha的IgG。脐血抗L-Rha的IgG的存在说明婴儿可从母体中获得此抗体。其次,通过与单糖的结合实验,L-Rha抗体特异性结合L-Rha（或其衍生物）或其结构类似物（如L-Ara）,而不能与D-Rha或其他D-构型单糖结合。然后通过与细菌LPS的结合实验,L-Rha抗体特异性结合非还原端是L-Rha或其衍生物的LPS。此外,通过补体介导的杀菌实验,L-Rha抗体特异性杀伤O-antigen非还原端是L-Rha或其衍生物的细菌。最后,L-Rha或其衍生物在细菌血清型中的分布与细菌不同血清型发病率存在一定的关系。表面多糖非还原端是L-Rha或其衍生物的细菌血清型发病率或侵袭性较弱。本部分的研究结果表明,L-Rha抗体是一种广谱的杀菌抗体,在感染初期清除病原菌、维持免疫力方面发挥着重要作用。血液L-Rha抗体的水平可作为检测人免疫力水平的重要指标。而且,通过对细菌表面多糖的结构分析（是否含有L-Rha或其衍生物）,对细菌的致病性的分析具有一定的参考价值。此外,表面多糖非还原端是L-Rha或其衍生物的细菌多是条件致病菌,主要对免疫受损的人群（L-Rha抗体可能不足或活性降低）有致病性。因此,L-Rha抗体有潜力作为药物治疗由于L-Rha抗体不足导致的细菌感染。除了 L-Rha抗体,人体内还存在很多其它天然糖抗体。通过系统地分析天然糖抗体和细菌致病性的关系,对细菌感染的预防和细菌导致的疾病的治疗具有十分重要的意义。第二部分L-鼠李糖修饰的黑色素瘤抗原MAGE-A3的抗肿瘤活性研究黑色素瘤抗原（MAGE）在多种肿瘤细胞中都有表达。其中,MAGE-A3在黑色素瘤、骨髓瘤、膀胱癌、肺癌等肿瘤细胞中广泛表达。MAGE-A3可通过诱导机体产生特异性的细胞毒性T细胞（CTLs）杀伤肿瘤细胞。因此,MAGE-A3成为肿瘤免疫治疗的研究热点。然而使用MAGE-A3多肽或蛋白疫苗的黑色素瘤患者中只有不到30%观察到肿瘤的消退。此外,针对MAGE-A3的临床试验由于不稳定的治疗效果而处于停滞状态。这是由于MAGE-A3是自体抗原,免疫原性较弱,诱导产生CTLs的能力不够强。因此,提高MAGE-A3相关抗肿瘤疫苗的免疫原性是增强其抗肿瘤活性的关键。提高肿瘤抗原免疫活性的一个有效途径是在肿瘤抗原上连接异种抗原。异种抗原-肿瘤抗原被注射入人体后,异种抗原与体内大量存在的天然抗体结合,从而增强抗原递呈细胞（APCs）对肿瘤抗原的识别和摄取。本部分通过表达MAGE-A3多肽,并共价连接异种糖抗原L-Rha,制备L-Rha修饰的MAGE-A3多肽。然后,在L-Rha抗体的存在下对Rha-tMAGE-A3进行体外抗肿瘤活性研究。具体来说,我们首先表达了截短的MAGE-A3（tMAGE-A3）。tMAGE-A3可以与商品化的MAGE-A3抗体结合,说明我们选取的MAGE-A3片段很好地保留了 MAGE-A3的免疫反应性。此外,Rha-tMAGE-A3同样可以与MAGE-A3抗体结合,说明L-Rha的连接没有遮蔽tMAGE-A3的抗原识别位点。其次,NHS活化的L-Rha可以高效率地与任何含有自由氨基的多肽或蛋白相连。本实验中,Rha-tMAGE-A3上平均偶联了 9个L-Rha,偶联效率达到75%。最后,通过巨噬细胞吞噬实验发现,在L-Rha抗体的介导下,相比于tMAGE-A3,Rha-tMAGE-A3能更好地被APCs识别并递呈。此外,在L-Rha抗体的介导下,Rha-tMAGAE-A3激活PBMCs产生特异的效应细胞,可以有效地杀伤黑色素瘤细胞A375。本部分的研究结果表明,Rha-tMAGE-A3具有很好的免疫原性和抗肿瘤活性。L-Rha作为免疫增强剂,在肿瘤的免疫治疗方面具有一定的应用价值。第三部分DNA编码糖抗原文库的制备和应用糖抗原与糖结合蛋白（glycanbindingprotein,GBP）的相互作用在多种细胞功能中扮演着重要的角色,例如识别、粘附、炎症等。此外,在多种疾病如肿瘤、病毒感染、动脉硬化、血栓、糖尿病、关节炎中,糖抗原的表达会发生异常,糖抗体的含量也可能随之发生变化。因此,研究糖抗原与GBP的相互作用对疾病的诊断和治疗具有重要意义。然而,研究糖抗原-GBP相互作用的手段非常有限。并且,包括糖芯片、ELISA等在内的方法都是将糖抗原固定在固相载体上,某些情况下会影响与GBP的结合或相互作用。此外,一个糖芯片一次也只能检测一个样品。一些非常少量的样品,甚至满足不了糖芯片的检测要求。最近,利用DNA扩增的信号放大作用,DNA标记的化合物应用于检测一些痕量的结合物。此外,DNA编码化合物库（DNA encoded library,DEL）技术被各大医药公司应用于高通量、高样本量地筛选目标化合物。本部分中,通过将DNA标记化合物技术和DEL技术结合,我们开发了检测糖抗原-GBP相互作用的新方法---DNA编码糖抗原文库（DNA encoded glycan library,DEGL）技术,此方法同时兼备了高灵敏性、高通量和高样本量。具体来说,DEGL中每一个糖抗原都连上一条独有的DNA片段。DEGL在与GBP进行亲和筛选后,通过第二代测序（next generation sequencing,NGS）技术对筛选出的糖-DNA进行DNA序列的识别,从而得知糖抗原的结构信息。具体来说,我们首先合成了 12种糖抗原,并在每种糖抗原上连接一段独有的DNA序列,制备了单价糖-DNA（每条DNA连接1个糖抗原）和多价糖-DNA（每条DNA连接3个糖抗原）。通过qPCR,本实验制备的单价血型糖抗原-DNA不仅可以检测商品化的血型抗体,还可以通过检测血清和唾液辨别血型,准确率高。此外,本实验制备的单价或多价糖抗原-DNA可以检测GloboH抗体（VK9抗体）和凝集素HPA、ECA。以上结果说明,糖抗原-DNA不仅可以检测标准化抗体,也可以检测血清、甚至是唾液等复杂的、低抗体含量的样品。进一步地,将单价糖-DNA混合制备单价-DEGL。同样地,将多价糖-DNA混合制备多价-DEGL。然后,单价-DEGL或多价-DEGL与抗体（GloboH抗体、L-Rha抗体）或凝集素（HPA、ECA）反应后,通过NGS进行检测。结果发现,多价-DEGL 比单价-DEGL的富集指数更高,即分辨率更高。此外,多价-DEGL检测到ELISA难以检测的较弱的结合（糖抗原BB3与Globo H抗体）,有明显的信号放大作用。DEGL的制备不同于传统DEL的制备（基于Split&Pool）。其中,糖抗原的化学酶法合成、sugar-encoding DNA的编码逻辑、糖抗原与DNA的交联（点击化学）、糖-DNA 的纯化（HPLC）和检测（ELISA、MALDI-TOF、bioanalyzer、qPCR、NGS）等系统性地设计和条件优化为DEGL的制备提供了一套完整的方案。本部分的研究结果表明,DEGL（特别是多价-DEGL）能够成功地应用于抗体、凝集素以及复杂样品的高灵敏度、高通量和高样本量检测。接下来,通过本部分提供的DEGL的制备方法,继续扩充DEGL的糖抗原-DNA的种类,使其应用性更广泛。可以预见的是,DEGL在医药研发、疾病诊断等领域将会有广泛的应用。总之,本论文通过对L-Rha抗体的制备和分析,探究了 L-Rha抗体的特异性和杀菌活性,并找到了与细菌发病率的关系;通过对L-Rha修饰的黑色素瘤抗原的制备和免疫学应用,为黑色素瘤等肿瘤的治疗提供了新的疫苗设计思路;通过对DEGL的制备和应用,提供了检测糖抗原-GBP相互作用的新手段。以上研究成果对疾病的诊断、分析和治疗具有重要意义。