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四妙勇安汤作为古代治疗脱疽的经典名方沿用至今,对动脉粥样硬化、静脉血栓为主的心脑血管疾病、糖尿病及慢性并发症、风湿免疫疾病、肿瘤等多种类型的疾病均有确切的治疗效果。四妙勇安汤组方精当,但所含有的组分复杂,多种成分的相互作用和多种因素的相互影响使得该复方的药效物质基础和作用机制尚未阐明。炎症反应是多种疾病的致病因素和起始病因,许多疾病的发生发展与炎症作用的影响密不可分。文献报道与课题组前期的研究显示:四妙勇安汤发挥多种药效作用可能与抑制炎症反应有关,但其发挥抗炎作用的药效物质基础、作用靶点以及如何发挥药效作用,尚未阐明。因此,本实验首先基于液质联用技术对四妙勇安汤水煎液灌胃给予健康SD大鼠后吸收入血成分进行分析鉴定,为该复方药效物质基础的研究提供依据;再结合网络药理学和分子对接技术对四妙勇安汤具有抗炎作用的潜在活性成分进行筛选并预测其抗炎机制;进而结合入血成分和文献报道,以木犀草素、山奈酚、异甘草素三种成分为研究对象,进行体内代谢研究,为阐明四妙勇安汤的药效物质基础及作用机制奠定基础;并基于单核-巨噬细胞炎症模型,筛选四妙勇安汤及三种单体成分的细胞安全给药浓度;进行细胞给药与检测,从磷酸化ERK1/2表达及炎症因子的变化初步探讨其体外抗炎药效作用机制。探索“化学成分-网络药理学-代谢研究-疗效验证”的研究模式,为中药药效物质基础研究提供快捷、多维度的研究策略。研究具体内容如下:1四妙勇安汤水煎液吸收入血成分分析将健康SD大鼠随机分为两组,给药组灌胃给予四妙勇安汤水煎液;空白组灌胃等体积蒸馏水,连续7天,每天2次。末次给药1 h后,腹主动脉取血,样本经处理得含药血清和空白血清。采用UHPLC-LTQ-Orbitrap技术,对四妙勇安汤水煎液含药血清进行分析鉴定。采用Waters AQUITYUPLC BEH C18柱(2.1 mm × 100 mm,1.7 μm),流动相(A)和(B)分别为0.1%的甲酸水溶液和乙腈,梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1;高分辨质谱采用热喷雾离子源,负离子检出模式。结合成分一、二级质谱信息、对照品质谱信息和相关文献,共得到成分21个,鉴定出异甘草素等原型成分7个,甘草次酸等代谢产物14个,其中有4个成分因多级质谱裂解碎片信息不够全面,未能推测出结构。本实验为四妙勇安汤药效物质基础的研究奠定了基础。2基于网络药理学和分子对接的四妙勇安汤抗炎作用机制研究本章节基于网络药理学的思路,以四妙勇安汤为研究对象,通过TCMSP数据库对四妙勇安汤全方的化学成分进行检索,以文献报道的活性成分、大鼠的入血成分和ADME参数为依据筛选出活性成分共128个,共匹配到药物靶点247个。基于GeneCards数据库和OMIM数据库,筛选炎症作用相关靶点1507个。将四妙勇安汤主要活性成分相关靶点基因及炎症相关靶点基因构建网络,共获得交集靶点145个,进行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析,并将槲皮素等6个关键活性成分与STAT3等4个关键蛋白进行分子对接研究,对四妙勇安汤抗炎药效作用机制进行预测。结果表明,四妙勇安汤发挥抗炎药效主要是通过槲皮素、木犀草素、山奈酚和异甘草素等多种潜在活性成分作用于STAT3、AKT1、MAPK等关键靶点,从而对多种生物学功能及信号通路起到调节作用而达到抗炎疗效。这也说明了四妙勇安汤是通过多成分、多靶点、多通路协同发挥药效作用。3木犀草素、异甘草素、山奈酚三种成分在大鼠体内的代谢分析将32只健康雄性SD大鼠随机分为4组,三组给药组分别给予20 mg·mL-1的三种对照品混悬液,空白组给予等体积CMC-Na。四组大鼠分别于灌胃给药后的10 min,30min,1h,1.5 h,2h,4h,6h进行眼眶取血,经样本处理后合并各时间点血样得空白血浆和含药血浆;收集大鼠0～24h的尿液和粪便,经样本处理后得尿液样本和粪便样本。采用UHPLC-LTQ-Orbitrap技术,对大鼠血液、尿液和粪便样品的原型成分及代谢产物进行分析鉴定。采用Waters AQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm× 100mm,1.7μm),流动相(A)和(B)分别为0.1%甲酸水溶液和乙腈,梯度洗脱,流速为0.3 mL·min-1;高分辨质谱采用热喷雾离子源,负离子检出模式。根据文献报道、结合对照品的质谱裂解规律及化合物的碎片信息,对相关成分进行分析推断。木犀草素给药后在血浆中鉴定出成分10种、在尿液中鉴定出成分11种、在粪便中鉴定出成分3种;异甘草素给药后在血浆中鉴定出成分6种、在尿液中鉴定出成分13种;山奈酚给药后在血浆中鉴定出成分8种、在尿液中鉴定出成分3种、在粪便中鉴定出成分1种。三种成分在大鼠体内的代谢途径相似,得到的成分除原型成分外其余多为Ⅱ相代谢产物。4单核-巨噬细胞炎症模型的建立与细胞给药浓度的筛选本章节采用浓度为100 ng·mL-1的PMA诱导,联合1μg·mL-1的LPS刺激,成功建立了单核-巨噬细胞炎症模型。结合大鼠入血成分、网络药理学研究结果和相关文献报道,筛选了度值较高并与蛋白结合潜力较好的木犀草素、异甘草素和山奈酚三种成分,通过CCK-8实验,确定了四妙勇安汤冻干粉和三种单体成分的细胞给药浓度范围。四妙勇安汤在浓度为0～500 μg·mL-1范围、木犀草素在浓度为0～2.5 μg·mL-1范围、山奈酚在浓度为0～5 μg·mL-1范围、异甘草素在浓度为0～7.5 μg·mL-1范围时对细胞无明显毒性,因此选择此浓度范围作为该实验细胞给药的安全浓度。5四妙勇安汤及其活性成分抗细胞炎症药效作用机制的初步探讨本章节基于单核-巨噬细胞炎症模型,以全方四妙勇安汤和活性成分木犀草素、山奈酚和异甘草素为研究对象,从磷酸化ERK1/2表达及炎症因子的变化初步探讨其体外抗炎药效作用机制。得出木犀草素和山奈酚能够在一定程度上抑制LPS诱导的THP-1源巨噬细胞炎症,其机制可能与抑制ERK1/2磷酸化蛋白水平及降低细胞炎症因子的表达有关;四妙勇安汤和异甘草素对抑制ERK1/2磷酸化蛋白水平改善巨噬细胞炎症反应未显示有直接作用。