脂肪酶是一类重要的水解酶,广泛存在于动物、植物、微生物中。我国开展脂肪酶的相关研究较晚,与国外有较大的差距,对海洋脂肪酶的研究更少。酶催化条件温和,副产物少,能催化酯化、转酯、水解、醇解等多种化学反应,在食品加工、医药卫生、能源开发和环境保护方面均有重要应用,但由于游离脂肪酶利用成本高,稳定性较差,难以实现连续化操作,限制了脂肪酶的应用范围。为了提高脂肪酶的利用效率,更好的应用于工业化生产,本文建立了海洋脂肪酶YS2071的固定化方法,通过筛选载体,优化固定化条件,制备了固定化酶。研究了固定化酶的性能,并探讨了固定化酶应用于生物柴油的转化。研究结果分述如下:固定化酶的制备:筛选11种树脂载体,比较固定化酶活、酶活回收率和蛋白吸附率,确定MI-BSI伯胺功能基吸附树脂为最优载体。通过单因素试验法对脂肪酶固定化的条件进行优化,以京尼平为交联剂,吸附-交联的方法,分析了加酶量、吸附时间、温度、pH、交联剂浓度、交联时间等因素对脂肪酶固定化效果的影响,并通过PB试验和响应面试验,确定了最佳固定化条件:加酶量为2 mg/mL的酶液,吸附时间8 h,温度为20℃,pH 8.6,交联剂的浓度为0.48 g/L,交联时间为1 h时,固定化效率最高,最大酶活可达到936.71 U/g,酶活回收率达到63%。固定化酶的性能研究:对游离酶和固定化酶的性能进行了比较,游离酶和固定化酶的最适作用温度均为40℃,最适作用pH为9,但固定化酶热稳定性和pH稳定性有显著提高。与游离酶相比,固定化酶对金属离子、有机溶剂的耐受性增强,稳定性较好。储存30 d,固定化酶仍保留65%的活性,游离酶仅有34%的活性。重复使用10次后,固定化酶的残余酶活力仍保留在32%,具有良好的操作性。固定化酶生物柴油的转化:薄层色谱法对标准品和转化产物定性分析,高效液相色谱法对乙酯和甘油酯的混合样品定量分析,确定流动相为丙酮:乙腈=64:36(V/V)。对稻米胚油、玉米油、葵花籽油进行转化,研究加酶量、含水量、醇油比、温度、时间对乙酯转化率的影响。研究发现,稻米胚油的乙酯转化效率最高,并通过正交试验进一步优化转化条件。确定稻米胚油转化乙酯的最优条件为加酶量为40 mg/mL,含水量0.125%,温度40℃,醇油比4:1,时间30 h。进行验证试验,在最优条件下对稻米胚芽油转化,转化率可达到43.8%。