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前言与目的神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤。临床表现多样,根据发病年龄,肿瘤部位,范围,生物学等的不同,预后差别很大。在治疗上,NB的治疗主要包括手术、化疗、放疗和生物治疗,以及在某些慎重选择情况下的单纯观察等。治疗的强度主要根据高、中、低风险的不同有所差别。尽管采取了多种治疗手段,高风险组的5年生存率仍然低于40%。目前化疗在NB的治疗中仍起着关键作用,人们一直在探索新的有效化疗方案。近20年来,喜树碱及其衍生物由于具有独特的DNA拓扑异构酶I(topoisomeraseI,TopoI)抑制能力,在肿瘤化疗领域开始广泛应用。有文献报道,由于未分化的NB比神经节母细胞瘤及正常肾上腺组织具有更高的TopoI活性,TopoI也是NB治疗的新靶点。伊立替康(CPT-11,Irinotecan,IRN)为TopoI抑制剂,又是作用于微管蛋白合成的药物,为细胞周期S期特异性药物,目前主要用于结肠癌等的治疗。几年来的临床前研究和临床试验结果表明,IRN在NB中有一定疗效。化疗一直是以直接杀伤肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞生长为目标。近些年发现一些细胞毒性化疗药物低剂量、短间隙或持续给药可以选择性地抑制肿瘤组织内新生血管内皮细胞的生长,使肿瘤细胞因为血供不足而生长受阻因而现出明显的抗肿瘤血管生成作用,从而抑制肿瘤生长和转移,这种低剂量,节律性(lowdose metronomics,LDM)化疗,也叫抗血管生成化疗。这种给药模式,除了有效抑制血管内皮细胞的增殖,也可以在很大程度上避免化疗的毒副作用,如骨髓抑制,肝肾功能损害,消化道反应及耐药性产生等,从而增加患者的依从性,提高生活质量(Quality of life,QOF),延长生存时间。在NB领域,由于血管生成和更具侵袭性的临床表型相关,而且促进血管生成的分子似乎在高风险肿瘤中不同程度表达,临床前试验中应用抗血管生成药物治疗NB取得了不同程度地成功。目前,关于抗血管生成治疗药物和其他化疗药物及治疗方式配伍的研究也越来越多。LDM化疗给药方式基于其抗血管生成的作用机制,在NB的治疗中,极有可能在和其他药物和治疗方式联合应用的时候,达到药效增强,同时又被很好耐受。环磷酰胺(Cyclophosphamide,CPS,CTX)是目前研究的最多的LDM化疗药物,也是治疗NB的常用化疗药物。根据我们以往的研究和国外文献报道,TopoI抑制剂拓扑替康和CTX联合应用治疗NB取得了一定的疗效。IRN和拓扑替康是同一类化疗药物,具有比拓扑替康更轻的血液学毒性。因此,本实验拟在体外培养NB细胞KCNR和建立KCNR裸鼠皮下移植瘤模型,应用IRN和CTX传统最大耐受量(Maximum ToleratedDose,MTD)给药方式或LDM给药方式进行治疗,观察单药和联合用药的毒性、疗效和进行初步机制探讨。并且在细胞实验和动物实验基础上,结合国外相关临床试验结果,征得伦理委员会及患者或家属同意,临床上应用IRN和CTX LDM化疗治疗复发转移难治性NB,观察化疗毒性、疗效及进行患者QOF评价,初步明确NB晚期患者是否可以从该化疗中获益。方法1.体外培养NB细胞系KCNR细胞,应用MTT法检测IRN(SN-38)与CTX(4-HC)单药及联合应用对NB的细胞毒作用。2.建立NB细胞系KCNR裸鼠皮下移植瘤动物模型。应用不同剂量及给药方式CTX,IRN及两药联合应用治疗2疗程。每周测量2次裸鼠体重及肿瘤体积,做肿瘤生长曲线,当裸鼠体积大于1500mm~3,杀死裸鼠,记录死亡时间,做Kaplan-Meier生存曲线,进行生存分析。取治疗后肿瘤标本,应用TUNEL法检测凋亡,分别应用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)及Wester-blot检测CD31及VEGF表达。3.临床上,选择复发转移难治性晚期NB患者,应用IRN单药或者IRN联合小剂量CTX持续口服进行治疗,观察毒性反应;评价疗效,统计临床获益率(Clinicat Benefit Response Rate,CBR);评价QOF。4.对实验结果应用Students t检验等进行统计分析并对生存曲线进行log-rank检验比较分析,P＜0.05认为有统计学意义。结果1.SN-38(IRN)和/或4-HC(CTX)对KCNR细胞具有细胞毒作用。联合用药组与单药组组间存在显著性差异(P＜0.01)。2.不同剂量及给药方式CTX及IRN单药均可不同程度的抑制KCNR裸鼠皮下移植瘤的生长,延长生存时间。联合应用IRN及MTD CTX或LDM CTX都比单一用药起到更好的治疗作用,两种联合用药方式疗效无显著性差异。联合用药组与单药组组间差别有统计学意义(P＜0.01)。但是IRN和MTD CTX联合应用出现了实验动物药物相关性死亡和体重明显下降,不能被很好耐受。IRN和LDM CTX联合应用实验动物可耐受。凋亡细胞数目:IRN+CTX-40(LDM)＞IRN＞CTX-40(LDM)＞对照组,但CTX-40(LDM)与对照组凋亡细胞数目无显著差异,包含IRN的治疗组(单药及联合用药组)与对照组相比凋亡细胞明显增多。CD31,VEGF表达:对照组＞IRN＞CTX-40(LDM)＞IRN+CTX-40(LDM),但IRN与对照组差别不明显,包含CTX-40(LDM)的治疗组(单药及联合用药组)表达较对照组明显降低。3.初步临床观察结果表明,IRN单药治疗晚期NB患者耐受良好,主要副反应为血液学毒性,主要表现为中性粒细胞减少等。总体临床获益率(ClinicalBenefit Rate,CBR)为42.9%。大部分患者QOF获得改善。对于晚期NB患者应用IRN联合小剂量CTX口服,根据我们初步观察到的结果,患者耐受良好,并观察到有患者维持了长达半年的无进展生存。结论1.IRN与CTX联合治疗NB取得非常好的疗效。2.IRN与CTX分别主要通过凋亡和抗血管生成方式抑制NB肿瘤生长,是一种非常合理、安全的配伍方式。