目的:中药地黄(Rehmanniaglutinous)是炮制生熟异治的典型代表,地黄多糖(PRG)是地黄的重要药效部位,地黄炮制过程会中对多糖含量和结构有影响。通过对PRG的提取分离纯化,对比生、熟地黄多糖的化学组成结构和体外抗氧化性的差异,将进一步明确地黄在炮制前后的化学变化,为阐明地黄生熟异治的炮制原理奠定基础,为完善地黄质量标准提供科学依据。以秀丽隐杆线虫(C.elegans)为模型,研究生、熟地黄总多糖和中性多糖部位的抗衰老作用及其差异,并深入研究抗衰老作用机制。方法:1.生、熟地黄粗多糖和精制多糖的提取和纯化以去离子水为溶剂进行提取,提取液过滤并浓缩,以80%乙醇去杂,沉淀部分复溶后以sevage试剂除蛋白,得到了较为精制的生、熟地黄总多糖,采用DEAE-52纤维素色谱柱和Sephadex G-100葡聚糖凝胶色谱柱对生、熟地黄粗多糖进一步精制。分别以水和不同浓度NaCl溶液作为洗脱剂进行洗脱,以苯酚-浓硫酸法进行检测,合并多糖部分,重复上样5次后,得到生、熟地黄精制多糖。2.生、熟地黄多糖的化学表征采用苯酚-浓硫酸法测定生、熟地黄总多糖和精制多糖的含量:利用试剂盒对PRG样品中的蛋白质含量进行检测;利用红外光谱分析进行PRG官能团的结构分析和鉴定。采用酸水解及1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法对生、熟地黄总多糖和精制多糖进行处理,进行超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱联用仪(UPLC-Q-TOF-MS)分析,比较生、熟地黄总多糖和精制多糖中单糖组成及其差异。采用酸水解及PMP柱前衍生化法对生、熟地黄总多糖和精制多糖进行处理,进行超高效液相色谱串联三重四极杆液质联用仪(UPLC-QQQ-MS)进行分析,比较生、熟地黄总多糖和精制多糖中单糖的百分含量。3.生、熟地黄多糖的体外抗氧化能力测定及分析以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法来测定PRG的清除DPPH自由基的能力,以Vc作为对照来表示PRG体外抗氧化能力的大小,并进行PRG体外抗氧化差异性分析评价。4.生、熟地黄总多糖对线虫抗衰老作用初探通过抗应激能力、生殖、体长、运动、寿命及活性氧含量等抗衰老相关指标研究生、熟地黄总多糖对线虫的抗衰老的作用及差异。5.生、熟地黄精制多糖对线虫抗衰老机制的研究以脂褐素实验直观验证精制地黄多糖的抗衰老活性,以咽泵实验和大肠杆菌OP50(E.coli OP50)生长实验排除热量限制寿命延长机制。通过线虫体内抗氧化酶含量测定和sod-3p::GFP融合蛋白表达实验解释生、熟地黄多糖抗应激机制,通过DAF-16核定位实验,寿命相关基因的表达实验和转基因线虫模型的寿命试验最终确定线虫寿命延长的机制。结果:1.生、熟地黄总多糖和生、熟地黄中性多糖的制备对生、熟地黄总多糖进行了提取后,通过柱色谱对地黄多糖进行进一步纯化得到了生、熟地黄中性多糖。由于生、熟地黄中酸性多糖含量极低,相较于中性多糖可以忽略不计,因此精制的生、熟地黄多糖以中性多糖为主。2.生、熟地黄多糖的化学表征生、熟地黄的粗多糖得率分别为22.92%和18.75%;纯化后生、熟地黄中性多糖的得率分别为12.09%和8.33%。通过对生、熟地黄总多糖和中性多糖样品中多糖含量的测定得生地黄总多糖(TPRR)和熟地黄总多糖(TPRRP)中多糖含量分别为71.26%和66.71%,生地黄中性多糖(NPRR)和熟地黄中性多糖(NPRRP)中多糖含量分别为83.35%和81.22%,仍分别含有13.32%和19.06%的蛋白质。通过红外光谱分析,生、熟地黄中性多糖红外光谱吸收峰相同,都具有相似的中性多糖特征吸收峰群。生、熟地黄总多糖的单糖组成中均有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖,这说明生、熟地黄总多糖的单糖组成上没有差异。生、熟地黄中性多糖中均含有除了半乳糖醛酸以外的5种单糖。PRG中的葡萄糖和半乳糖占绝大部分,而其他单糖含量不超过5%。熟地黄多糖中葡萄糖和半乳糖占比大于生地黄多糖。3.生、熟地黄多糖具有一定的体外抗氧化活性Vc、TPRR 和 TPRRP 的半数清除率(IC50)分别为 0.0021、0.1291、0.1845 mg/mL,数据表明TPRRP和TPRR的消除该自由基的效率分别是Vc的1.60%和1.10%,这表明PRG具有一定的体外抗氧化能力,TPRRP的体外抗氧化能力强于TPRR,但与Vc相比体外抗氧化能力较弱。4.生、熟地黄总多糖具有一定的抗衰老作用TPRRP在不影响线虫繁殖和运动能力的前提下,具有延长线虫寿命的作用。生、熟地黄多糖都能提高线虫对热应激和氧化应激的抗性。另外,TPRRP还能对线虫的生长发育起到正向作用。通过活性氧簇(ROS)的形成实验,进一步验证了 PRG抗应激和延长线虫寿命的机制有可能是通过降低ROS的含量,提高线虫的氧化应激能力,减少氧化损伤。5.生、熟地黄中性多糖通过胰岛素/胰岛素样生长因子信号传导通路(IIS)延长线虫寿命地黄的作用机制可能为抑制daf-2的转录活性,进而抑制线虫体内的胰岛素信号受体DAF-2对该信号通路的负调控作用,相对于正常状态下,转录因子DAF-16会更多的入核表达,进而调节抗胁迫基因的表达,提高线虫抗应激能力,进而延长线虫寿命。结论:本实验建立生、熟地黄多糖提取分离纯化方法,通过化学表征研究了炮制前后地黄多糖的含量变化;通过对PRG的单糖组成和含量分析,比较了生、熟地黄总多糖之间、中性多糖之间的异同。利用C.elegans模型比较了生、熟地黄多糖在抗衰老药效作用的异同。通过对生、熟地黄总多糖抗衰老作用的初探为精制的中性多糖的抗衰老机制的研究奠定了基础。通过线虫寿命相关实验和生物分子技术确定了生、熟地黄多糖抗衰老的信号通路为IIS。