白芷和北沙参作为中国传统中药,在河北省均有广泛种植与分布,为河北省道地中药材。二者均是伞形科植物的干燥根,其主要成分是香豆素类化合物。近几十年来,国内外学者对其进行了一定程度的研究,包括化学成分、质量控制、药理作用及作用机理等。本课题在总结前人研究工作的基础上,对两种药材的化学组成、质量控制标准以及药代动力学方面进行了进一步的研究,以期实现对其有效的和科学的质量控制。本研究结合硅胶柱层析、制备HPLC等方法对白芷醇提取物进行分离纯化,从中得到6种香豆素类化合物,在此基础上建立了白芷11种香豆素类化合物的HPLC-MS定性定量分析方法,并初步探讨了大鼠灌胃白芷提取物后主要香豆素成分的药动学特性。建立了北沙参药材的HPLC指纹图谱分析方法,并利用相似度软件对不同产地的北沙参指纹图谱分析结果进行了评价。另外,本研究还建立了同时测定北沙参药材中6种香豆素类化合物含量的HPLC分析方法。本课题结合了天然药物化学、分析化学、药代动力学等的方法和手段,研究了中药白芷和北沙参的化学成分、质量评价及体内过程,为中药做了有意义的探索。第一部分河北道地药材白芷香豆素类成分的分离制备与含量测定以及药动学研究目的:1.从白芷中分离制备补骨脂素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、cnidilin和异欧前胡素6种香豆素类单体成分。2.利用HPLC-MS的方法对白芷中11种香豆素化合物进行定性、定量研究。3.利用HPLC的方法对白芷中5种香豆素化合物进行了药动学研究。方法:1.白芷化学成分的制备:结合硅胶柱层析、制备HPLC等方法对白芷醇提取物进行分离纯化,通过薄层、UV、HPLC、1H NMR, 13C NMR和MS等方法对分离产物进行结构确认。2.含量测定:(1)样品处理方法:比较了不同提取方式、提取溶剂及提取时间对白芷有效成分的提取效率,选择重复性好,提取效率高的提取方法。(2)色谱条件的优化:考察了不同的流动相、质谱条件、色谱柱等影响因素,确定最佳的色谱条件。(3)样品的定性分析:通过待测组分的保留时间、分子离子和碎片离子信息与对照品化合物信息相比较来确认待测化合物,进而推断其裂解规律。(4)方法学考察:分别进行了标准曲线的制备、精密度、回收率、稳定性的研究。(5)样品测定:在已确定的色谱条件下,测定12批白芷药材11种香豆素化合物的含量。3.药动学研究:白芷乙醇提取物经硅胶柱层析以石油醚-乙酸乙酯(5:1,4:1,3:1,2:1,1:1)为洗脱剂进行梯度洗脱后,收集5:1和3:1部分悬浮于0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液中,大鼠口服给予提取物混悬液后,分别于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、15和24 h由眼眶静脉取血,置于肝素化塑料离心管中,血浆样品采用甲醇沉淀蛋白的方法,色谱柱为C18柱,流动相为乙腈-水梯度洗脱,流速为1 ml/min,检测波长310 nm。以血浆药物浓度为纵坐标,取血时间为横坐标绘制曲线,根据中国药典(2005版)中的有关规定计算药动学参数。结果:1.白芷化学成分的制备:提取分离得到6种香豆素化合物,分别鉴定为补骨脂素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、cnidilin和异欧前胡素。所得6个化合物用归一化法定量,纯度均大于98%。2.含量测定:(1)提取条件的优化:白芷用75%甲醇超声提取30 min,使各待测组分同时达到最大的提取效率,且提取方法稳定。(2)色谱条件的优化:采用Waters SunfireTM C18(150 mm×4.6 mm I.D., 5μm),以甲醇-0.1%甲酸水(75:25)为流动相进行等度洗脱,流速0.8 ml/min,进样量5μl,柱温室温。ESI源:正离子检测;检测模式:multiple reaction monitoring (MRM);Temperature:400℃;ionSpray Voltage:5500 V;ion Source Gas 1:40 psi;ion Source Gas 2:40 psi;collision Gas:Medium;curtain Gas:20 psi。(3)样品的定性分析:11种香豆素的分子离子有[M+H]+、[M+Na]+、[M+NH4]+、[M+K]+ ,碎片离子有[M+H-CO]+、[M+H-C5H9O]+、[M+H-C5H8]+、[M+H-C5H8-CO]+、[M+H-C5H8-CO2]+、[M+H-CH3]+。(4)方法学考察:11种香豆素化合物的线性关系均良好(r>0.99),线性范围分别为:340~10880、62.4~1996、216~6912、45.4~1452、19.8~635、222~7104、1680~53760、1330~42560、744~23808、2.7~87.6、735~23520 ng/ml,日内和日间精密度(RSD)分别在1.2%~4.5%和0.4%~4.0%之间,回收率范围在92.1%~108.0%之间,样品在24 h内稳定性。(5)样品测定:12批白芷药材中11种香豆素含量在132.8~589.3μg/g之间。3.药动学研究:补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、cnidilin和异欧前胡素的线性范围分别为26.0~833.3、28.1~897.8、74.9~2396.2、48.0~1536.1和45.5~1360.1 ng/ml,日内和日间精密度(RSD)分别在2.7%~14.8%和0.1%~14.5%之间,提取回收率在87.1%~109.2%之间,大鼠口服给药后5种主要药效成分的动力学参数如下:Cmax:811.4 ng/ml、588.9 ng/ml、2070.2 ng/ml、753.8 ng/ml和870.9 ng/ml;Tmax:4.0 h、4.0 h、5.0 h、5.0 h和5.0 h;T1/2:8.57 h、6.13 h、6.47 h、6.86 h和6.91;k值:0.0809 1/h、0.1130 1/h、0.1070 1/h、0.1010 1/h和0.1003 1/h;AUC0?t:4157.4 ng h/ml、2777.6 ng h/ml、11322.1 ng h/ml、3948.5 ng h/ml和5110.8 ng h/ml;AUC0?∞:4791.8 ng h/ml、2918.3 ng h/ml、12037.4 ng h/ml、4210.0 ng h/ml和5323.6 ng h/ml。结论:1.白芷化学成分的制备:成功制备了补骨脂素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素、cnidilin和异欧前胡素,经波谱、色谱分析,可满足定性定量以及药物代谢动力学研究的需要。2.含量测定:采用HPLC-MS法建立了白芷中11种香豆素化合物同时定性、定量的测定方法,其专属性强,精密度良好,结果准确可靠,为白芷药材的质量控制提供了良好的分析方法。3.药动学研究:建立了同时测定血浆中补骨脂素、佛手柑内酯、欧前胡素、cnidilin和异欧前胡素的高效液相色谱法,并将其应用于SD大鼠口服白芷提取物后5种香豆素化合物的药动学研究。该方法具有较高的灵敏度和专属性,经方法学验证,方法具有良好的精密度和准确度,符合生物样品分析的要求。第二部分河北道地药材北沙参HPLC指纹图谱研究和香豆素类成分的同时测定目的:1.指纹图谱研究:建立河北道地药材北沙参的HPLC指纹图谱,得到对照指纹图谱,并与不同产地北沙参药材指纹特征相比较,计算相似度。2.含量测定:对北沙参中6种香豆素化合物(补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、欧前胡素、cnidilin和异欧前胡素)进行含量测定,为科学评价与有效控制北沙参药材质量提供新方法。方法:1.指纹图谱研究:(1)提取条件的优化:比较了不同提取方式、不同提取溶剂、不同提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。(2)色谱条件的优化:考察了不同的流动相、波长、柱温等影响因素,确定最佳的色谱条件。(3)系统适用性试验:在确定的色谱条件下,考察指纹图谱中补骨脂素色谱峰的分离度和理论板数。(4)方法学考察:分别进行了精密度、重复性、稳定性的考察。(5)指纹图谱的建立:分别取道地北沙参药材13批和其他不同产地的北沙参样品6批,制备样品溶液,进行指纹图谱分析、相似度评价。2.含量测定:(1)提取条件的优化:比较了不同提取方式、提取溶剂及提取时间对北沙参有效成分的提取效率,选择重复性好,提取效率高的提取方法。(2)色谱条件的优化:考察了不同的流动相、波长、柱温等影响因素,确定最佳的色谱条件。(3)系统适用性试验:在确定的色谱条件下,考察花椒毒素色谱峰的分离度和理论板数。(4)方法学考察:分别进行了标准曲线的绘制,精密度、回收率、稳定性的考察。(5)样品测定:在确定的色谱条件下,测定19批北沙参药材中6种香豆素化合物的含量。结果:1.指纹图谱研究:(1)样品的处理方法:75%甲醇超声提取30 min,重复性好,提取效率高。(2)色谱柱为DiamonsilTM C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5μm),柱温30℃,检测波长为295 nm,甲醇-乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脱,流速1.0 ml/min,进样体积20μl。(3)系统适用性试验:补骨脂素色谱峰的理论板数约为6.0×103,与其它色谱峰的分离度大于1.5。(4)方法学考察:精密度试验:计算各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.9%和1.5 %,说明精密度良好。重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.3%和2.4%,说明重复性良好。稳定性试验:各主要色谱峰峰面积的RSD分别小于0.3%和2.2%,说明样品溶液在24 h内稳定。(5)指纹图谱的建立及数据分析:首先得到13批道地药材北沙参的指纹图谱及其17个共有峰,运用相似度评价系统2004A版软件计算,13批河北道地药材相似度均在0.9以上,批间差异较小。对6批不同产地的北沙参药材与河北道地药材生成的对照指纹图谱相比相差较大,相似度只在0.1~0.4之间。2.含量测定:(1)样品处理方法:75%甲醇超声提取30 min,使各有效成分在提取方式相同的条件下同时达到最大的提取效率,且提取方法稳定。(2)最佳的色谱条件:C18色谱柱(250 mm×4 mm I.D.,5μm),柱温30℃,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 ml/min,检测波长310 nm。(3)系统适用性试验:花椒毒素色谱峰的理论板数约为8.0×103,与其他色谱峰的分离度大于1.5。(4)方法学考察:六种香豆素化合物的线性关系均良好(r>0.99),线性范围分别为:0.52~10.42、0.89~17.84、0.32~6.40、0.26~5.27、0.05~0.96和0.17~3.49μg/ml,日内和日间精密度(RSD)分别在0.2%~2.7%和0.3%~1.7%之间,回收率范围在91.7%~107.6%之间,样品在24 h内稳定性。(5)样品测定:19批北沙参药材中6种香豆素化合物的含量在338.3~1353.2μg/g之间。结论:1.指纹图谱研究:建立了北沙参药材的HPLC指纹图谱分析方法,并利用相对保留值系统和相似度软件对不同产地的北沙参药材指纹图谱分析结果进行了评价,本方法方便、可靠,为北沙参药材的质量控制提供依据。2.含量测定:采用HPLC-DAD法建立了北沙参6种香豆素化合物多组分的测定方法,其专属性强,精密度和稳定性良好,结果准确可靠,为保证北沙参药材的质量提供了良好的质量控制方法。