金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌,近年来在速冻食品中污染严重。致病的金黄色葡萄球菌可产生肠毒素,一旦速冻食品被污染,解冻后在合适温度条件下可大量繁殖并产毒,从而引起食物中毒。两年前,我国在饺子、肉圆等馅类速冻食品中检出金黄色葡萄球菌,造成了严重的经济损失和食品安全事故。金黄色葡萄球菌对于低温具有较好的适应性。因此研究金黄色葡萄球菌在低温胁迫后性质变化,可为冷冻食品中金黄色葡萄球菌的控制提供理论依据。本文从冷冻食品中分离得到多株金黄色葡萄球菌,对其再生长能力、耐冷冻能力进行了评价,获得一株低温适应能力较强的菌株,经冷诱导后测定其对其他环境适应能力的变化。同时,长期冷诱导可使金黄色葡萄球菌产生小菌落突变体。该小菌落突变体与其野生型相比,生长形态,生物被膜形成能力,对抗生素的耐受性发生变化。选择4种常见杀菌剂对其产生的生物被膜进行清除,为控制这类小菌落突变体提供理论方法和指导。主要研究结果分述如下:1.冷冻食品中金黄葡萄球菌分离及其耐冷冻能力的测定。从超市农贸市场采集的36份冷冻食品检测金黄色葡萄球菌,其中冷冻肉制品的污染率较高,总体检出率为16.7%。在传统培养法的基础上运用PCR快速检测法,PCR 阳性样品再进行生理生化检验,最后通过16srDNA测序确定。最终分离得到7株金黄色葡萄球菌命名为S.aureus W1、S.aureus W2、S.aureus W3、S.aureus J1、&aureus J3、S.aureusJ4、S.aureus J5。对分离得到的金黄色葡萄球菌进行长期冷处理,测定其低温耐受能力。结果发现S.aureus W3对-20℃耐受能力最强,经8w冷胁迫后,菌体数几乎没有发生变化,S.aureus J3对4℃耐受能力最强,处理8周后菌体数仅下降0.76 1g(CFU/mL)。而标准菌株CICC10201对-20℃的耐受能力较所有分离株差,处理8周后菌体数下降2.27 1g(CFU/mL)。另对分离菌株冻融循环的耐受能力进行了评价。结果发现,经9个冻融循环后,分离菌株的菌体数呈上升趋势,其中S.aureus J1上升最为显著。随着冻融循环数量的增加,菌体数逐步下降。而标准菌株菌体数总体呈下降趋势,表现出比分离株对冻融循环的更强敏感性。2.冷诱导金黄色葡萄球菌对其他环境耐受能力测定及安全控制。选择耐冷菌株S.aureus W3与标准株5.aureus CICC10201分别在4℃下冷胁迫5h后,测定其对不同温度、pH、渗透压、过氧化氢、酒精环境处理的存活率及耐冷菌株生物被膜形成能力及清除。结果表明,耐冷菌比标准株对高温耐受性更强,且经冷诱导后,两种菌在45℃-60℃环境下存活率均有所提高。冷诱导使金黄色葡萄球菌对酸性pH环境敏感性增强但对碱性pH环境产生交叉抗性。冷诱导后的菌体在高渗环境的存活率降低,最低下降了 24.09%。另外,冷诱导后,两株菌对不同消毒剂的敏感度也发生了变化,30%的酒精浓度处理后,两株菌的菌体数较未诱导前分别多1.92和2.071g(CFU/mL),说明冷诱导后金黄色葡萄球菌对酒精的耐受性增强。同时,耐冷株W3在诱导前后对35-50mM浓度过氧化氩耐受性没有显著变化,但对标准菌株S.aureus CICC10201其敏感性增强,存活率下降。耐冷株W3较标准株具有更强的生物被膜形成能力,运用1%84消毒水能有效清除其生物被膜。3.冷诱导金黄色葡萄球菌小菌落突变体的形成及控制。金黄色葡萄球菌S.aureus CICC10201在-20℃下诱导3w后形成小菌落突型菌体,对其生长、营养缺陷型、形态、耐药性及生物被膜形成能力的变化进行了分析。结果表明,形成的小菌落突变型菌体生长缓慢,延滞期增长,到达对数期时间延后2h左右。37℃培养24h后,菌落大小显著小于原始菌株(p<0.05),且其在血平板上的溶血圈减小,革兰氏染色变浅。冷诱导形成的小菌落突变型属于甲萘醌缺陷型菌株,在MHB培养基中几乎不生长,但在添加0.1μg/mL甲萘醌后可正常生长。传代3代以上,该突变体会发生回复突变现象。冷诱导形成的小菌落突变体对多种药物耐受性增强,特别是氨基糖苷类药物(庆大霉素、卡纳霉素),而对四环素、氯霉素、环丙沙星的敏感性增强。在NB培养基中培养24h后,小菌落突变体生物被膜形成能力强于其野生型,且生物被膜相关基因(icaADBC)表达量上升,运用1%的84消毒水或3%过氧化氢能最大程度去除生物被膜。