扎托布洛芬(Zaltoprofen,ZPF),属于COX-2优先抑制剂非甾体类抗炎药,对急性和慢性炎症均有较强的抑制作用,其对胃肠粘膜的不良反应较低,在人医中被广泛应用。扎托布洛芬的抗炎镇痛作用和安全性已在人体和动物实验中得到证实,具有开发兽用抗炎药物的前景。药物在动物体内的代谢、排泄与残留消除规律研究是评估新兽药安全及食品安全的重要科学依据,然而关于扎托布洛芬的代谢和残留消除的研究很少,国内无相关文献报道。放射性同位素能使被标记化合物在机体内准确定位,具有高特异性、高灵敏度和易检测等优点,被广泛应用于药物在机体内的处置研究。为了全面揭示扎托布洛芬在猪和大鼠体内的变化过程与规律,科学评价其安全性,本课题合成了氚标记扎托布洛芬,并采用放射性示踪、静态液闪计数仪(LSC)、高效液相色谱串联在线同位素检测仪(HPLC-v.ARC)以及液相色谱与离子阱飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)联用技术,进行了扎托布洛芬在猪和大鼠体内的代谢、排泄、组织分布和残留消除研究。鉴定了扎托布洛芬在猪和大鼠的代谢物并推测了其代谢途径,分析了各代谢物在猪和大鼠体内的残留消除规律,推荐了在猪体内的残留靶组织和残留标示物。本研究为临床合理用药提供了理论依据,进而为其食品安全性标准的制定提供科学依据。1氚标记扎托布洛芬的合成方法与质量标准以2-(3-羧甲基-4-苯硫基苯基)丙酸为原料,酯化后与溴素进行取代反应,使溴标记在苯环上,再与多聚磷酸进行关环缩合,关环后将酯基水解得到4-溴扎托布洛芬,最后使其与氚气在钯碳催化作用下发生氚-溴交换,制得4-~3H-扎托布洛芬粗产物,再采用制备液相色谱仪对粗产物进行分离纯化。经质量标准研究,分离纯化后获得的氚标记扎托布洛芬(~3H-ZPF)具有高化学纯度(≥99%)、高放化纯度(≥98%)和高比活度(29.30 Ci/g),在-20℃存储6个月其化学纯度和放化纯度依然可保持在98%以上,表明其稳定性良好,质量标准满足动物实验的要求。2扎托布洛芬在猪和大鼠体内的物料平衡与代谢研究30日龄杜长大三元杂交去势猪4头和8周龄Wistar大鼠6只一次性肌肉注射给予氚标记扎托布洛芬,给药剂量为5 mg/kg b.w.,给药比活度为0.15 Ci/g。给药后不同时间点收集动物尿液和粪便,检测不到放射性为止。取收集的各时间段的尿液、粪便、血液和胆汁样品,各样品经消化后用LSC测定总放射性,分析扎托布洛芬在猪和大鼠体内的物料平衡和排泄规律;另取各样品适量,经提取净化后采用LC-v.ARC和LC/MS-IT-TOF进行检测,对其放射性化合物进行定性定量分析。试验结果表明,给药后0 d-1 d,猪和大鼠的药物累积回收率均达80%以上;给药后0 d-7 d,两种动物的药物累积回收率均达到90%以上,在14 d的收集期内,猪以及雌性和雄性大鼠的药物累积回收率分别为95.82±0.51%、96.97±7.28%和94.77±5.76%。在猪中,约74.80%药物通过尿液排泄,21.13%通过粪便排泄;然而在雌性和雄性大鼠中约26.61%和17.23%药物通过尿液排泄,79.73%和68.16%通过粪便排泄。结果表明扎托布洛芬在猪和大鼠中排泄迅速,排泄集中于0 d-1 d,之后排泄量迅速减少,但主要排泄途径存在显著差异,大鼠可能通过胆汁排泄较多,在猪体内则可能存在胆汁排泄和重吸收过程。猪和大鼠共检测到8种放射性化合物,分别为原型Z0、S-氧化-10-羟化扎托布洛芬Z1、S-氧化-扎托布洛芬Z2、10-羟化-扎托布洛芬Z3、R-扎托布洛芬葡萄糖醛酸结合物Z4、S-扎托布洛芬葡萄糖醛酸结合物Z5、R-10-羟化-扎托布洛芬葡萄糖醛酸结合物Z6和S-10-羟化-扎托布洛芬葡萄糖醛酸结合物Z7。在猪尿液样品中发现Z0和7种代谢物(Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7),在大鼠尿液样品中发现原型Z0和5种代谢物(Z1、Z2、Z3、Z4、Z6);在猪粪便样品中发现原型Z0和5种代谢物(Z1、Z2、Z3、Z6、Z7),在大鼠粪便样品中发现原型Z0和3种代谢物(Z1、Z2、Z3);在猪和大鼠血液中均检测出Z0和Z3;在猪胆汁中检测出Z0。猪和大鼠分别检测到8和6种放射性化合物,其中Z5和Z7仅存在猪尿液中。根据扎托布洛芬在猪和大鼠体内的代谢情况,推测扎托布洛芬的代谢特征主要为:一是发生羰基还原反应;二是发生硫氧化反应;三是同时发生硫氧化和羰基还原反应;四是扎托布洛芬的葡萄糖醛酸结合反应,五是羰基还原后再进行葡萄糖醛酸结合反应。3扎托布洛芬在猪和大鼠体内的分布与消除研究30日龄杜长大三元杂交去势猪28头和8周龄Wistar大鼠42只随机分为7组,一组为空白组,其余6组为试验组,猪和大鼠试验组均连续7 d肌肉注射给予氚标记扎托布洛芬,给药剂量分别为5 mg/kg b.w.和10 mg/kg b.w.,给药比活度为0.15Ci/g。在停药后不同时间点分别宰杀一只空白组动物和一组试验组动物(猪为12 h、3 d、7 d、14 d、21 d和28 d,大鼠为12 h、1 d、3 d、7 d、14 d和21 d),收集心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、血液和胆汁等(血浆和胆汁样品主要用于代谢试验)。取少量收集的组织样品加入消化液进行水浴消化,消化完全后采用静态液闪仪检测其总放射活度,得到扎托布洛芬在动物组织中的分布特征;同时取一部分主要组织样品,经甲醇提取净化后采用LC-v.ARC和LC/MS-IT-TOF进行检测,对其放射性化合物进行定性定量分析。扎托布洛芬及其代谢物在猪中分布广泛,停药后12 h各组织中放射性产物的含量均很高,其中胆汁中的药物浓度最高,其次是肾脏、肾上腺、肝脏、肌肉和消化系统,在心脏、脾脏、肺脏、脂肪、皮肤和膀胱中的浓度相对较低。停药后3 d药物浓度下降迅速,胆汁下降约20倍,肾上腺下降约5倍,肝脏和肌肉下降约3倍,其他大多数组织约为12 h浓度的1/2。停药后7 d和14 d所有组织依然可以检测到放射性。停药后21 d,脂肪和胃中检测不到放射性,肝脏和肾脏中浓度较高分别为69±3μg/kg和135±21μg/kg。停药后第28 d,组织中均检测不到放射性。在猪的主要组织中,共检测到3种放射性物质Z0、Z2和Z3。肝脏中能检测到Z0和Z3;肾脏中能检测到Z0、Z2和Z3;肌肉和脂肪中均检测到Z0和Z2;停药后7 d只能检测到Z0。在四种组织中,Z0为主要代谢物,比例均占90%以上。停药后0.5 d-3 d猪各个组织中药物浓度下降较快,3 d-21 d药物消除相对缓慢。消除半衰期较长的组织有肝脏、脾脏、肾脏和注射肌肉,半衰期在5.32 d-6.14 d之间;其次为心脏、背腰肌、胃、小肠、皮肤、膀胱和血液,消除半衰期在5.06 d-5.18 d之间;再次为肺脏、大肠、肾上腺和胆汁,消除半衰期在4.68 d-4.92 d之间;消除最快的组织为脂肪,消除半衰期为3.93 d。其中药物在肝脏和肾脏样品中残留量最高,停留时间最长,消除最慢,半衰期分别为5.50 d和6.14 d,肝脏和肾脏可作为猪体内残留靶组织,肝脏和肾脏中Z0半衰期分别为5.36 d和6.05 d,与总消除趋势一致,确定Z0作为猪体内的残留标示物。扎托布洛芬在大鼠体内同样分布广泛,停药后12 h消化系统的放射性含量最高,其次是肝脏、肾脏和肌肉等,在脂肪、皮肤和生殖腺中的浓度相对较低,在脑中浓度最低。停药后1 d药物浓度下降迅速,胃和大肠下降约20倍,小肠下降约40倍,肌肉和脂肪下降约10倍,其他组织中的药物浓度约为12 h的1/2。3 d所有组织中的药物浓度约为1 d浓度的1/2。停药后7 d所有组织依然可以检测到放射性。停药后14 d,肝脏和肾脏中的药物浓度较高分别为134±22μg/kg和215±90μg/kg,21 d大鼠体内组织中检测不到放射性。在大鼠的主要组织中,共检测到4种放射性物质Z0、Z1、Z2和Z3。肝脏中检测到Z0、Z2和Z3;肾脏中检测到Z0、Z1、Z2和Z3,;肌肉和脂肪中均检测到Z0和Z2。停药后3 d只能检测到Z0。在四种组织中,Z0为主要代谢物,比例均占90%以上。大鼠各个组织停药后0.5 d-1 d,药物浓度下降较快,为快消除相,1 d-14 d药物进入慢消除状态。其中心脏、肝脏、肾脏和肌肉的消除较为缓慢,半衰期在5.05 d-6.78 d之间;其次为肺脏、胃、脑、生殖腺和血液,消除半衰期在4.01 d-4.99 d之间;脾脏、皮肤、大肠和小肠的消除相对较快,半衰期在3.09 d-3.92 d左右;脂肪消除最快,半衰期为2.03 d。其中药物在肝脏和肾脏样品中消除最慢,半衰期分别为5.87 d和6.78 d,肝脏和肾脏中Z0消除最慢,半衰期分别为5.80 d和6.33 d。综上所述,本研究首次合成并获得了符合质量标准的氚标记扎托布洛芬,科学阐明了扎托布洛芬在猪和大鼠体内的代谢、排泄、组织分布与残留消除规律,鉴定了扎托布洛芬在猪和大鼠不同样品中的代谢物并推测其代谢途径,分析了各代谢物在猪和大鼠体内分布和残留消除规律,推荐了扎托布洛芬在猪体内的残留靶组织和残留标示物。本文研究结果为揭示扎托布洛芬为临床合理用药提供了理论依据,并为其安全性评估的制定提供了较为全面的信息。