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家族性高胆固醇血症(FH)是一种常染色体单基因显性遗传性疾病,FH的主要临床表现为血浆总胆固醇(TC),特别是低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著升高,皮肤肌腱黄色瘤及早发冠心病等。LDLR基因突变是引起FH最常见的原因,临床确诊的FH患者中约一半以上为LDLR基因突变。本课题组共收集30多个FH家系,已发现20种LDLR基因点突变,包括16种点突变、2种剪接突变和2种缺失突变,但这些突变是否具有致病性,其致病机制如何均不清楚。为了明确高脂血症的原因,深入了解FH的分子学机制和发病机理,本实验在突变分析的基础上,选用6种突变进行突变体构建和功能研究。[目的]以6例临床确诊的FH患者为研究对象,对各患者进行LDLR基因突变分析,构建野生型和突变体LDLRcDNA真核表达载体,将构建的各表达质粒转染HEK-293细胞,通过各突变体与野生型比较,重点观察各突变对LDLR表达和功能的影响,初步探讨突变对LDL代谢的作用及突变致FH的分子机制,并为突变患者采取早期治疗,防治心血管疾病及产前诊断和家族性研究等提供理论基础。[方法]取6例临床确诊FH患者EDTA-Na2抗凝血各0.5ml,用酚-氯仿法提取基因组DNA,以基因组DNA为模板,采用PCR结合DNA测序方法排除ApoB基因Q3500R突变;同时以患者基因组DNA为模板,采用降落PCR方法,在同一程序中扩增LDLR基因的启动子和全部18个外显子共21个片段,直接进行DNA测序鉴定突变。用Trizol法从正常人肝细胞中提取总RNA并纯化,并以纯化RNA为模板,反转录PCR合成LDLRcDNA全长;将LDLRcDNA全长与PTA2载体连接、转化大肠杆菌、筛选菌落、提取质粒酶切和测序鉴定,将正确PTA2载体克隆质粒送交广州复能基因公司负责组装到真核表达载体pReceiver-M29,构建成含LDLR全长和EGFP绿色荧光蛋白融合表达的载体。以野生型表达载体为模板,用QuickChange XL system诱变试剂盒(Stratagene)构建6种突变体(357delG, 675delA, C210R, T383I, A459V, S565X)并经测序证实。将野生型及6种突变体质粒转染HEK-293细胞,同时设一空白对照(未转染任何基因),转染48h后提取总蛋白,采用Western检测LDLR蛋白;另外,将野生型及构建的6种新突变体质粒瞬时转染HEK-293细胞,48h后分别在4℃和37℃与稀释在培养基中的DiI-LDL共孵育,流式细胞仪分别检测LDLR结合、内化LDL的能力。[结果]各FH患者均未检测出ApoB100Q3500R突变,LDLR突变分析发现6个新突变,包括3个错义突变(C210R, T383I, A459V)、2个缺失突变(357delG,675delA)和一个无义突变(S565X)。筛选得到正确LDLR及突变体表达载体,测序结果无碱基突变及阅读框移码。Western检测显示,与野生型比较,C210R, T383I, A459V三种错义突变蛋白条带无显著变化;S565X出现一条截短的蛋白条带;2个缺失突变(357delG,675delA)出现一条更短的蛋白条带。与野生型比较,6个LDLR基因新突变体导致细胞结合能力、内化能力均明显降低,分别约为野生型的13%-34%,13%-35%。[结论]1、成功构建6种LDLR新突变体。2、6个LDLR基因新突变均损伤LDLR功能,细胞结合能力明显降低(13%-34%),内化能力也明显降低(13%-35%),其中LDLR基因突变型A459V结合能力、内化能力均为最高(分别为34%,35%),LDLR基因突变型675delA结合能力、内化能力均为最低。3、根据突变患者临床表型和突变体功能实验证实6种突变是导致血浆胆固醇增高的致病性突变。