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猪瘟(classical swine fever,CSF)是猪的一种高度致死性传染病,其病原体猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)为黄病毒科瘟病毒属成员。CSFV的基因组为正义的单股线状RNA,大小约12.3 kb,由两端的非翻译区(nontranslated region,NTR)和中间一个大的开放阅读框(open reading frame,ORF)构成。其ORF编码一条大的多聚蛋白(polyprotein),Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B,经细胞和/或病毒编码的蛋白酶加工产生12种成熟的蛋白。其中非结构蛋白3(nonstructural protein 3,NS3)为一种多功能的蛋白,在病毒基因组复制和感染性病毒的产生中具有重要作用。本论文研究了 CSFV NS3的结构与功能,主要获得了以下成果:采用原核表达系统表达纯化了全长的NS3,在其N端融合了 NS3蛋白酶辅因子 NS4A 的多肽片段(NS4A protease cofactor segment,NS4APCS),以下称为NS4APCS-3。将NS3丝氨酸蛋白酶活性位点突变(S163A),构建了 NS3蛋白酶自切割活性丧失的突变体NS4APCS-3S163A。通过大肠杆菌大量表达,亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析进行分离纯化,制备了高纯度的NS4APCS-3S163A蛋白,经结晶初筛和条件优化,得到了高质量的八面体状晶体。经过X-ray衍射数据收集、分子置换和模型优化,解析出了 2.35 A的NS4APCS-3S163A晶体结构。发现了一个新的闭合式构象(closed conformation),其C末端的5个氨基酸插入蛋白酶的活性口袋,类似于一种NS3-NS4A顺式切割(cis-cleavage)后的状态,且蛋白酶结构域位于解旋酶结构域的背面,主要与解旋酶结构域3相互作用,形成了一个大小约2200 A2的分子内相互作用界面;在NS3表面发现了一个连续的碱性区,推测可能参与解旋酶对底物的结合,尤其是蛋白酶表面的碱性区,暗示NS3蛋白酶对解旋酶刺激作用的分子机制。基于全长NS3的结构分析,将NS3分子内主要的界面相互作用分成3簇,第一簇包含了蛋白酶活性位点P侧(P-side)与解旋酶结构域3 C末端(残基679-683)的相互作用;第二簇包含了三个离子键和边缘的一个疏水性帽子;第三簇由蛋白酶N端桶状结构(N-barrel)的β7b-β8发卡结构,解旋酶结构域3的loop(残基559-563)和解旋酶结构域D2-D3 linker形成。针NS3界面的三簇相互作用,设计了 3组突变,分别引入NS3表达质粒和CSFV全长感染性克隆,研究了界面氨基酸突变对NS3 ATPase和helicase活性的影响,及对CSFV复制和蚀斑形成能力的影响。结果表明,界面突变导致NS3解旋酶活性出现不同程度的下降,但其ATPase活性却不受影响;病毒学试验表明,界面突变会显著降低感染性病毒的产生,病毒的蚀斑形成能力也显著下降。进一步对蛋白酶结构域表面参与形成连续碱性区的4个氨基酸进行突变研究。分别将H24(位于NS4APCS),R50,K74,K94(位于NS3蛋白酶)突变为非极性的丙氨酸和酸性的天冬氨酸后,突变体NS3的ATPase活性不受影响,而helicase活性普遍下降;基于CSFV感染性克隆的突变分析表明,NS3蛋白酶结构域表面碱性氨基酸突变显著降低了 CSFV基因组的复制和感染性病毒的产生。以上结果暗示CSFV NS3蛋白酶结构域表面碱性区通过与RNA的结合在基因组复制的调节中发挥作用。我们的研究结果有助于加深对CSFV NS3结构与功能的关系以及NS3在病毒基因组复制和感染性病毒产生中作用机制的理解,为阐明CSFV的致病机制和发展疾病防治新技术提供了新的理论依据。