近年来,侵袭性真菌感染（Invasive Fungal Infections,IFIs）的发病率和死亡率呈明显上升趋势,临床上真菌耐药性问题日趋严重,而用于治疗深部真菌感染的药物存在毒副作用大、抗菌谱窄、易产生耐药等诸多不足,因此,发现全新结构类型和作用机制的先导化合物成为抗真菌药物研究的重要方向。目前,抗真菌药物研发主要有以下策略:（1）现有抗真菌药物的优化和改进;（2）发现抗真菌新靶点并设计特异性的抑制剂;（3）基于表型筛选的先导化合物发现和靶标确证。对现有药物进行结构优化和改进难以避免其固有作用机制带来的缺陷。因此,本文基于抗真菌新靶点Pdr1–Gal11A KIX蛋白,设计合成了两类全新结构的抗真菌先导化合物,并针对课题组前期研究发现的咔啉类先导化合物进行深入的抗真菌作用机制研究。一、基于Pdr1–KIX相互作用的抗真菌先导物的设计、合成和活性研究本研究基于Pdr1–Gal11A KIX蛋白-蛋白相互作用,以抑制剂iKIX1为先导化合物,通过分析iKIX1与KIX蛋白的氢键作用模式图,设计、合成了19个肼硫代甲酰胺类衍生物。通过体外抗真菌活性测试,确证iKIX1对于光滑念珠菌有中等抑制活性(MIC₅₀=1mg/mL)。构效关系表明,硫脲结构是其发挥活性的关键基团,将硫脲结构中的硫原子替换为氧原子活性丧失,骨架苯环上引入供电基、芳环、芳杂环均不能提高活性。但是,苯环上硝基取代的化合物5q、乙炔基取代的化合物12a对光滑念珠菌和新生隐球菌的抑制活性均优于先导化合物iKIX1,与阳性对照药氟康唑相当。采用秀丽隐杆线虫真菌感染模型进行初步的体内抗真菌药效研究,结果表明,化合物5q、12a能在一定程度上延长线虫的生存期。二、吡唑硫代酰胺类新型抗真菌先导物的发现、优化和活性研究在对IKIX1进行合成的过程中,意外分离得到一个副产物7a,经核磁、质谱鉴定,确定该化合物结构为5-氧代-2,5-二氢-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺。经体外抗真菌活性测试,发现其对三种常见致病真菌均具有优秀的体外抗真菌活性（MIC值为0.016-0.25mg/mL）,是一个全新抗真菌分子骨架。本研究以7a为先导化合物,对其进行三个方面的结构优化。首先,对5-氧代-1,2-吡唑酮环进行骨架跃迁,用变构的3-氧代-1,2-吡唑酮环替换,并在环上引入乙酰基;其次,对骨架苯环进行取代基优化,引入卤素、烷基、芳香环等取代基;最后,在化合物7a杂环上引入疏水性基团苯环。经体外抗真菌活性测试,优选得到抗真菌活性最好的化合物7a、6d和11a,并进行初步作用机制研究和的体内抗真菌药效考查。结果表明,化合物7a、6d和11a可以抑制真菌被膜形成,可以有效延长新生隐球菌感染线虫的生存期。此外,化合物7a可以浓度依赖地抑制新生隐球菌生长,且明显优于氟康唑;在小鼠系统性感染模型中,化合物7a对新生隐球菌感染小鼠表现出一定的体内抗真菌活性。三、咔啉类化合物的抗真菌活性和作用机制研究课题组前期通过表型筛选、结构优化,发现了具有优秀抗隐球菌活性的咔啉类化合物JYJ-19和JYJ-20（MIC值为0.25-1mg/mL）,但该类化合物的体内抗真菌活性、作用机制和作用靶点并不明确。本研究建立了小鼠系统性隐球菌感染模型,对该类化合物的体内药效进行考察;对其作用机制进行深入研究,考察化合物对真菌增殖、生物被膜、黑素、尿素酶形成、细胞表面疏水性等新生隐球菌毒力因子的抑制作用,考察化合物作用下真菌细胞形态学改变和对细胞周期的影响。根据研究结果,进一步考察化合物可能的作用通路。体内活性测试结果表明,化合物JYJ-19可以显著提高系统性新生隐球菌感染小鼠的生存期。作用机制实验结果表明,化合物JYJ-19和JYJ-20呈浓度依赖地抑制真菌细胞的增殖,对黑素、被膜和细胞表面疏水性有较好的抑制作用。透射电镜结果显示,在化合物JYJ-19作用下,真菌细胞核固缩、染色体凝集、细胞膜和细胞壁均受损,与对照药氟康唑作用下的损伤结果不同;细胞周期结果表明,JYJ-19阻滞真菌细胞于G2期,而氟康唑阻滞真菌细胞于G1期。以上结果提示该类化合物可能具有全新的作用机制,为了进一步探索该类化合物的作用机制,通过Western Blot实验考察其可能的作用通路。结果表明,化合物JYJ-19作用下,Cdc25C和CDK1蛋白表达量上调,该类化合物可能作用于CDK1-CyclinB通路。综上所述,咔啉类化合物具有优秀的体内外抗隐球菌活性,其作用机制新颖,为隐球菌病治疗药物的研究提供了新的思路。