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乙型肝炎病毒是严重威胁人类健康的一种病毒,特别是对于我国来说。乙型肝炎病毒的X基因只有154个氨基酸,但是它的功能十分复杂。其对人肝细胞有短期和长期的影响。了解HBX与肝细胞相互作用的结果是研究该疾病发生的生理和分子机制的基础。本论文利用改进的酵母双杂交技术平台来研究HBX蛋白质与寄主蛋白的相互作用,其内容主要有以下几个方面:
(1)酵母双杂交诱饵载体pDBleu-X的构建。最初的双杂交系统是invitrogen公司的PROQUSTTM Two-hybrid system,后经实验室改造在诱饵pDBLeu载体插入一个带有强启动子Prrn的GFP作为反选择标记。通过无酶克隆的方式将HBX基因装入pDBleu中。
(2)构建5×cDNA有限文库,并且鉴定文库的质量。
(3)将pDBleu-X转化Mav203后,进行自激活的检测和3AT浓度的确定。利用改进的双杂交系统,筛选人类肝脏cDNA文库,对于筛选到的阳性克隆经质粒拯救、经过PCR鉴定后确定基因的信息,并共得到蛋白质相互作用对。
(4)对HBX进行生物信息学分析,并对相互作用对进行数据分析,初步提出互作的可能性和潜在意义。