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目的: Survivin是近年新发现的凋亡抑制蛋白(inhibition apoptosis protein,IAP)家族成员之一,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子,在胰腺癌组织中高表达而在正常组织中不表达,其表达与胰腺癌的细胞增殖、凋亡和血管生成密切相关。通过调低该基因的表达有助于抑制细胞增殖,逆转肿瘤形成。RNA干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达,已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建Survivin shRNA重组质粒转染胰腺癌Patu 8988细胞,体内、外观察shRNA表达载体对Patu 8988细胞Survivin基因表达的影响,以及对Patu 8988细胞生长的抑制作用,探讨Survivin基因在胰腺癌中的作用,为进一步研究胰腺癌的基因治疗奠定实验基础。方法:①软件分析Survivin mRNA结构以筛选出拟干扰靶位点,构建Survivin shRNA重组质粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2和pGenesil-1-Survivin- 1+2,同时构建阴性对照重组质粒pGenesil-1-NC,经酶切和测序鉴定后,提取各组重组质粒转染Patu 8988细胞;②实验分为空白对照组、pGenesil-1-Survivin-1组、pGenesil-1-Survivin-2组、pGenesil-1-Survivin-1+2组和pGenesil-1-NC组,分别进行体内、外实验;③在48 h时检测细胞凋亡,RT-PCR和FCM测定Survivin mRNA和Survivin蛋白的相对含量,以观察各重组质粒瞬时转染Patu 8988细胞后对Survivin基因表达的抑制作用;④MTT测定细胞增殖能力,Western-blotting测定Survivin蛋白的表达;⑤G418筛选获得各重组质粒的稳定转染Patu 8988细胞,接种BALB/c裸鼠,建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型,通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量,免疫组化测定Survivin蛋白表达,透射电镜观察瘤细胞超微结构,研究Survivin shRNA对胰腺癌移植瘤生长的抑制作用。结果:①酶切和测序鉴定证实重组质粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1- Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2和pGenesil-1-NC构建成功;②FCM测得各组转染细胞百分比均大于60%;瞬时转染48h,pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1-Survivin-2和pGenesil-1-Survivin-1+2对Patu 8988细胞Survivin mRNA抑制率分别是空白对照组的65.62%、54.89%、64.96%,与空白对照组相比差异具有显著性意义(p<0.05); FCM检测五组凋亡指数都很低,各组无差别;③MTT检测各组细胞增殖速度的比较表明,pGenesil-1-Survivin-1组、pGenesil-1-Survivin-1+2组转染细胞的增殖能力明显下降,pGenesil-1-Survivin-2组细胞的增殖能力有一定下降,但不如前两者;FCM测得Survivin蛋白抑制率分别为64.61%、32.68%和59.49% (与对照组相比,p<0.05), Western-blotting结果与FCM结果基本相符;④pGenesil-1-Survivin-1组和pGenesil-1-Survivin-1+2组移植瘤的平均成瘤时间略有延迟,与空白对照组相比差异无显著性(p>0.05) , pGenesil-1-Survivin-1组、pGenesil-1-Survivin-2组和pGenesil-1-Survivin-1+2组平均瘤体积、瘤重量明显下降;切片的免疫组化结果显示:瘤体组织大片状坏死,影响蛋白的正常表达;透射电镜显示各组瘤细胞凋亡很少,与PI检测细胞凋亡结果一致;⑤实验结果表明:pGenesil-1-Survivin-1组对Patu 8988细胞Survivin的干扰作用最好,抑制瘤细胞的增殖也最明显,略优于pGenesil-1-Survivin-1+2组,pGenesil-1-Survivin-2组干扰作用最差,而pGenesil-1-NC对Patu 8988细胞Survivin基因无明显干扰作用,对瘤细胞的增殖无明显影响。结论:成功构建Survivin shRNA重组质粒pGenesil-1-Survivin-1、pGenesil-1 -Survivin-2、pGenesil-1-Survivin-1+2和pGenesil-1-NC;三组重组质粒能在体内、外干扰Patu 8988细胞Survivin基因表达,抑制胰腺癌Patu 8988细胞增殖;5’–GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3’和5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’可作为胰腺癌Patu 8988细胞Survivin基因的RNAi靶点,前者明显优于后者。