研究背景原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤,其死亡率位居各类肿瘤第二位。现代精确放疗是治疗肝癌的常用手段之一。然而,在给予足以杀灭肿瘤组织放射剂量的同时常会损伤周围重要组织。而许多肿瘤由于其本身对射线抵抗或肿瘤内存在大量对放射线不敏感的乏氧细胞,即使给予足够的射线剂量仍无法有效控制肿瘤。因此,有关放射增敏剂的研究具有重要临床意义。多西紫杉醇是一种新型半合成紫杉醇类衍生物,体外研究表明,多西紫杉醇可诱导多种肿瘤细胞凋亡,影响细胞周期分布[1]。临床研究证实多西紫杉醇对多种肿瘤细胞有放射增敏作用且不加重正常组织的放射损伤,但有关多西紫杉醇对肝癌细胞的放射增敏鲜见报道。研究目的本实验研究旨在探索多西紫杉醇对人肝癌细胞株SMMC-7721的细胞毒性及放射增敏作用,为有效提高肝癌的放疗效果提供试验依据。实验方法(1)将复苏的人肝癌细胞系SMMC-7721进行传代培养,显微镜观察细胞形态变化,定期换液及传代,待细胞生长良好,进入对数生长期后进行试验。(2)MTT法测定多西紫杉醇对SMMC-7721细胞的生长抑制作用。(3)荧光倒置相差显微镜观察浓度为IC50的多西紫杉醇不同处理时间后的细胞形态学变化。(4)MTT法测定多西紫杉醇对SMMC-7721细胞的放射增敏作用。( 5)流式细胞分析方法检测多西紫杉醇联合放射线对细胞周期的影响。(6)流式细胞分析方法检测多西紫杉醇联合放射线对细胞周期影响的时效性。实验结果(1)人肝癌细胞系SMMC-7721传代培养3天后,细胞生长良好,进入对数生长期。(2)各浓度的多西紫杉醇分别作用3 h,6 h,9 h,12 h,24 h,48 h后,细胞抑制率随着药物浓度的增加而升高,随着药物作用时间的延长而升高,且药物浓度和处理时间之间存在协同作用。析因方差分析结果表明不同药物浓度处理组中除200μg/ml,400μg/ml外,其他各浓度处理组间两两比较均有显著统计学差异( F=15723.685,P =0.0000 ) ,不同处理时间组间细胞抑制率有显著统计学差异(F=11740.167,P=0.0000),不同浓度和时间协同组间细胞抑制率有显著统计学差异(F=739.916,P=0.0000)。多西紫杉醇对SMMC-7721细胞的IC50为21.69μg/ml,95%的可信区间为19.12μg/ml ~24.60μg/ml。确定随后的增敏实验选择浓度为:4μg/ml。(3)荧光倒置相差显微镜(200×)观察显示:正常肿瘤细胞呈团块状排列,团块内细胞数量不等,细胞间排列紧密;细胞大小不一,异形性明显,呈梭形或多角形;胞膜、胞浆等细胞内各结构清晰。胞核卵圆形,核膜清晰,核仁明显。药物作用于细胞后3 h:肿瘤细胞体积增大,胞膜、胞浆、核膜等细胞内结构显示不清,核仁尚清;6 h:多数细胞间出现融合现象,呈团块状,团块内细胞各结构均显示不清,细胞表面可见大小不等、分布均匀的空泡;9 h:细胞内空泡开始融合变大,细胞团内各结构显示更不清楚;12 h:细胞数目减少,细胞表面可见黑色颗粒并均匀分布,细胞团内各结构无法分辨,部分细胞固缩、变圆;24 h:细胞排列松散,细胞间隙增大,仅见模糊的细胞大体轮廓,细胞内各结构无法分辨,胞膜仍可见。细胞表面散在空泡,胞浆缺失。细胞开始固缩、溶解,并可见典型的核固缩、核碎裂及细胞变性坏死现象;48 h:细胞排列更为松散,胞膜不完整,表现为变性或溶解样坏死。(4)多西紫杉醇预处理3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h后照射,不同预处理时间组间SER有显著性差异( F = 32.43935,P = 0.0000),不同预处理时间组间两两比较均具显著性差异( P < 0.05)。各组SER分别为: 1.21、1.33、1.50、1.68、1.72、1.83,随预处理时间延长,SER逐渐增加,在预处理3 h～12 h期间,SER增高速率最快,此后随孵育时间延长,SER呈较为平缓增长趋势。(5)单纯4μg/ml多西紫杉醇处理和2 Gy照射均引起明显的细胞周期G2/M期阻滞,且多西紫杉醇与照射有协同作用。(6)随着多西紫杉醇预处理时间的延长,G2/M期细胞所占比例逐渐增加,多西紫杉醇预处理12 h、24 h、48 h,其G2/M期细胞比例分别为32.23%,50.23%,60.13%。结论多西紫杉醇对人肝癌细胞系SMMC-7721有明显毒性作用和放射增敏作用,其IC50为21.69μg/ml,95%的可信区间为19.12μg/ml~24.60μg/ml,放射增敏作用的机制可能与引起G2/M期阻滞,影响细胞周期的重分布有关。