DRG神经元PKA/cAMP调控Ca2+门控通道介导结肠平滑肌张力及疏肝健脾方干预研究

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目的基于DRG神经元PKA/cAMP调控结肠平滑肌Ca2+门控通道的影响,探讨疏肝健脾方治疗腹泻型肠易激综合征的可能机制。方法(1)按照随机对照研究法,将36只SPF级雄性SD大鼠按体重随机分成6组,每组6只,即正常对照组;中药低、中、高剂量组;西药组;肠易激综合征模型组。采用束缚-应激-辣椒素造模法2周后,中药组予低、中、高不同中药剂量灌胃,西药组给予匹维溴铵灌胃,模型组予等剂量生理盐水灌胃,第5周末起予处死全部大鼠,取出降结肠约2cm固定于张力换能器检测大鼠结肠平滑肌张力。(2)制备疏肝健脾方大鼠含药血清;分离并原代培养大鼠结肠平滑肌细胞,采用MTT法检测出不同浓度疏肝健脾类方药对结肠平滑肌细胞的影响,并使用流式细胞仪和Fluo-3AM荧光探针检测大鼠结肠平滑肌细胞内Ca2+含量变化。(3)分离并原代培养大鼠DRG(Dorsal root ganglion,DRG)细胞,采用免疫荧光法进行细胞鉴定,DRG细胞经辣椒素(Capsaicin,CAP)干预后分组(即低、中、高剂量组)予含药血清干预,运用RT-PCR及Western-blot检测大鼠DRG神经元中PKA/cAMP表达变化。结果(1)应用束缚应激-辣素造模方法制作IBS-D大鼠模型,并制备大鼠结肠平滑肌条,静息状态下,各组间结肠平滑肌肌张力变化无明显差异。加入乙酰胆碱后,肌条收缩频率加快,峰值增高,收缩加强,统计学无差异。加入1mg/ml、3 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml疏肝健脾方后,肌条收缩频率下降,峰值上升。治疗前、后比较有统计学差异(P<0.05)。(2)成功分离大鼠结肠平滑肌细胞,结肠平滑肌细胞形态呈椭圆形,束状排列,密集与稀疏处相互交错呈“峰谷”状。MTT法检测选择1.56%,0.78%,0.39%为最佳浓度进行钙离子检测,定量结果显示各组之间没有明显差异(P>0.05),而流式细胞仪检测显示正常组大鼠结肠平滑肌细胞Ca2+浓度显著低于低、中、高剂量组,并随着药物浓度增加,低、中、高剂量组的细胞内钙离子浓度逐步降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)成功分离大鼠DRG细胞,经细胞鉴定,证实成功分离大鼠DRG细胞;DRG细胞形态呈圆形,胞体较小,突起较长;各模型组DRG神经元中PKA的mRNA及蛋白表达量均低于正常对照组,并随着浓度的升高而上升,差异具有统计学意义(P<0.05),高剂量组cAMP的mRNA及蛋白表达量低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05),低、中剂量组则无差异(P>0.05)。结论疏肝健脾方可下调cAMP的表达,降低PKA的活化,抑制Ca2+内流,对结肠平滑肌收缩具有抑制作用,从而发挥防治肠易激综合征的作用。
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