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鼠李糖是许多细菌多糖的重要成分，比如脂多糖，胞外多糖，荚膜多糖和细胞壁多糖等;另外，含有鼠李糖的化合物在其它生物中也普遍存在，例如，这类化合物已在病毒、真菌、植物和低等动物等中发现，并参与许多重要的生理过程。自从上个世纪六十年代鼠李糖的生物合成途径被发现以来，研究者对其进行了广泛的研究，目前已取得许多成就:(1)阐明了三个鼠李糖糖供体，包括胸苷脱氧核糖二磷酸鼠李糖(dTDP-Rha)，尿苷核糖二磷酸鼠李糖(UDP-Rha)和鸟苷核糖二磷酸鼠李糖(GDP-Rha)的生物合成途径;(2)多种鼠李糖转移酶和鼠李糖糖苷酶的活性已被证实;(3)鼠李糖合成途径中所涉及的酶可以作为药物靶点;(4)含有鼠李糖的化合物已经应用于多种疾病的治疗。另外，生物信息学和各种实验数据均说明含有鼠李糖的化合物具有新药研发的巨大潜能。显然，人们需要对此类化合物进行更深入的研究。然而，目前来讲，含有鼠李糖的化合物的获取还比较困难，所以研究这类化合物需要首先解决的问题是如何获取结构均一和明确的化合物。基于化学酶法合成化合物的优点，利用鼠李糖转移酶合成含有鼠李糖的化合物成为研究热点。
肺炎链球菌含有丰富的糖基转移酶，这些糖基转移酶参与荚膜多糖的生物合成。目前，已有约200个糖基转移酶的功能被预测，它们具有开发成工具酶、应用于化学酶法合成化合物的潜能。据预测，23F型肺炎链球菌含有两个鼠李糖转移酶，因此，本课题开展了源自23F型肺炎链球菌的鼠李糖转移酶的研究。其结果不仅有益于含有鼠李糖的化合物的酶法合成，而且有益于针对分布广、危害大、预防和治疗方法有限的23F型肺炎链球菌的新药研发。为此，本研究还需要解决两个技术难点，一是鼠李糖转移酶的糖供体dTDP-Rha生物合成过程复杂，目前还没有商品化，获取困难;二是鼠李糖转移酶的糖受体在细菌内含量很少，化学合成也很困难，不易获得。我们的研究工作围绕上述目标和两个核心技术问题开展，本论文包括以下内容:
第一，本文首先综述了鼠李糖的研究背景。自从研究者发现鼠李糖在细菌中广泛存在，但是在哺乳动物却十分罕见以来，鼠李糖及其生物合成途径的研究就引起广泛的关注。特别是从天然材料中分离获得以及化学法合成的含有鼠李糖的化合物在肿瘤免疫治疗，肿瘤杀伤和抗菌感染方面的应用报道以来，含有鼠李糖的化合物的研究成为热门课题。但是，这类化合物的获取还面临许多困难。研究者希望利用化学酶法获得上述化合物。本文围绕化学酶法合成化合物的两大要素，即底物和工具酶展开综述。首先，目前已发现的三种鼠李糖糖供体(dTDP-Rha，UDP-Rha和GDP-Rha)的生物合成途径均已被阐述，相关酶的功能以及部分酶的晶体结构已被报道。其中，dTDP-Rha是应用最广泛的鼠李糖供体，其生物合成途径中涉及四个酶，即葡萄糖-1-P胸苷转移酶RmlA，dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶RmlB，dTDP-4-酮-6-脱氧-3，5-差向异构酶RmlC和dTDP-4-酮-鼠李糖还原酶RmlD，它们的功能和晶体结构已被报道。其次，已有鼠李糖转移酶体外生化证据的报道，这些酶包括来自于嗜热脂肪芽孢杆菌、刺糖多胞菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞杆菌和肺炎链球菌等。但是，当前研究鼠李糖转移酶活性的两种主要方法，包括基因敲除法和异源表达酶并以同位素标记底物的方法，没有能够获得相关的产物。再次，本文总结了含有鼠李糖的化合物在疾病治疗方面的探索。另外，由于肺炎链球菌具有丰富的糖基转移酶，这些糖基转移酶参与肺炎链球菌荚膜多糖的生物合成，具有进一步开发成工具酶的潜力。因此，本文对肺炎链球菌的研究历史、荚膜多糖的合成途径和肺炎链球菌的糖基转移酶的研究现状进行综述。最后，提出本研究的内容及其意义。
第二，本研究建立了一种一锅四酶合成dTDP-Rha的新方法。为了解决已报道的dTDP-Rha制备方法中成本高和产率低的问题，本研究建立一种合成dTDP-Rha的新方法。(1)来源于23F型肺炎链球菌的、参与dTDP-Rha合成的四个酶，葡萄糖-1-P胸苷转移酶Cps23FL，dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶Cps23FN，dTDP-4-酮-6-脱氧-3，5-差向异构酶Cps23FM和dTDP-4-酮-鼠李糖还原酶Cps23FO分别被克隆、表达和纯化，体外获取均一的酶。(2)研究证明Cps23FL能够催化Glc-1-P和dTTP反应生成dTDP-Glc和PPi，具有胸苷转移酶的功能。(3)本研究对Cps23FL的酶学性质进行研究，包括初速度范围、最佳反应温度、pH、离子种类、离子浓度和酶促动力学常数。(4)研究证明Cps23FN能够催化将dTDP-Glc转化成dTDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖，具有dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶功能。(5)本研究对Cps23FN的酶学性质进行研究，包括初速度范围、最佳反应温度、pH和酶促动力学常数。(6)本研究证明Cps23FM和Cps23FO能够催化形成dTDP-Rha，分别具有dTDP-4-酮-6-脱氧-3，5-差向异构酶和dTDP-4-酮-鼠李糖还原酶功能。(7)本研究建立一种有效的、一锅四酶合成dTDP-Rha的方法，产率63％。
第三，本研究以Cps23FL/N/M/O酶法合成19个核苷二磷酸糖。核苷二磷酸糖是糖基转移酶所需要的糖供体，在糖基转移酶活性检测、化学酶法合成化合物和酶抑制剂开发等方面具有重要意义。但是，许多核苷二磷酸糖没有商品化，合成途径复杂，不易获得。本文开展dTDP-Rha的研究过程中发现，Cps23FL可被用来酶法合成核苷二磷酸糖。(1)Cps23FL底物特异性分析研究显示，该酶能够识别5种糖-1-磷酸(Glc-1-P,Gal-1-P，GlcNH-1-P，GalNH-1-P和Man-1-P)和八种天然（脱氧）核苷三磷酸（dTTP,UTP,ATP,dATP,CTP,dCTP,GTP和dGTP）作为底物，形成17种核苷酸糖(dTDP-Glc，dTDP-Gal,dTDP-GlcNH，dTDP-GalNH，dTDP-Man,UDP-Glc,UDP-Gal,UDP-GlcNH,UDP-Man,ADP-Glc,dADP-Glc,dADP-GlcNH,CDP-Glc,dCDP-Glc,GDP-Glc,GDP-Man和口dGDP-Glc)。除Cps23FL合成17个糖之外，加上如前所述的dTDP-Rha和dTDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖，本研究共合成19个核苷酸糖。(2)本研究构建八个Cps23FL突变株(Q24S、Q24V、Q80A、Q80E、Q80S、Q88A、Q88S和口Q88T)。其中Q88A催化Glc-1-P与UTP的反应比野生型Cps23FL提高了6倍。
第四，本研究提供确切的证据证明了cps23FT编码β1，4鼠李糖转移酶，并以Cps23FT催化体外合成了二糖产物Rhaβ-Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn。研究者预测Cps23FT是鼠李糖转移酶，参与23F血清型肺炎链球菌荚膜多糖重复单元的生物合成，但是受体底物的难以获得限制了该酶的研究。(1)来源于23F血清型肺炎链球菌的Glc-1-P转移酶的全长序列Cps23FE和C-端序列Cps23FECT被克隆和表达，既获得含有目的蛋白的细胞总膜，也通过纯化体外获取均一的目的蛋白。(2)本研究通过内源性底物和外源性底物UndP证明Cps23FE和Cps23FECT催化合成Glcα-PP-Und，具有Glc-1-P转移酶活性，并且完整的膜结构对酶的活性是必需的。但是，没有获得纯化的Glcα-PP-Und。(3)来源于23F型肺炎练球菌的鼠李糖转移酶Cps23FT被克隆、表达和纯化，体外获取均一的酶。(4)本研究通过化学合成获得Cps23FT的天然受体底物类似物Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn，并证明该底物可以被用来研究Cps23FT酶活。(5)本研究详细研究纯化的Cps23FT酶学性质，包括初速度范围、最佳反应温度、pH、离子种类、离子浓度和酶促动力学常数，为其生物学功能提供生化证据。(6)Cps23FT的底物特异性研究说明受体底物的焦磷酸和脂链部分是鼠李糖转移酶识别所必需的部分。(7)本研究通过构建和分析Cps23FT四个突变株（D97A，D99A，D271A和D273A），初步认为271DKD273是该酶结合金属离子位点。(8)本研究利用Cps23FT，以dTDP-Rha作为鼠李糖糖供体，以Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn作为糖受体，获得二糖产物Rhaβ-Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn，产率为40％。
综上所述，本研究开展了源自23F型肺炎链球菌的鼠李糖转移酶及其相关酶的研究，具重要意义在于:(1)建立了有效合成dTDP-Rha和其它18种核苷二磷酸糖的新方法，对化学酶法合成化合物具有重要意义;(2)首次为源自23F型肺炎链球菌的dTDP-Rha合成酶、Glc-1-P转移酶和鼠李糖转移酶的功能提供了生化证据;(3)鼠李糖转移酶作为一种工具酶的表达和获得为化学酶法合成含有鼠李糖的化合物打下基础;(4)为酶法制备获取23F型肺炎链球菌荚膜多糖重复单元提供了基础，对后续的抗原表位研究、共同抗原筛选和新型疫苗研发具有重要意义;(5)本研究为研究肺炎链球菌荚膜多糖生物合成途径提供生化证据。
肺炎链球菌含有丰富的糖基转移酶，这些糖基转移酶参与荚膜多糖的生物合成。目前，已有约200个糖基转移酶的功能被预测，它们具有开发成工具酶、应用于化学酶法合成化合物的潜能。据预测，23F型肺炎链球菌含有两个鼠李糖转移酶，因此，本课题开展了源自23F型肺炎链球菌的鼠李糖转移酶的研究。其结果不仅有益于含有鼠李糖的化合物的酶法合成，而且有益于针对分布广、危害大、预防和治疗方法有限的23F型肺炎链球菌的新药研发。为此，本研究还需要解决两个技术难点，一是鼠李糖转移酶的糖供体dTDP-Rha生物合成过程复杂，目前还没有商品化，获取困难;二是鼠李糖转移酶的糖受体在细菌内含量很少，化学合成也很困难，不易获得。我们的研究工作围绕上述目标和两个核心技术问题开展，本论文包括以下内容:
第一，本文首先综述了鼠李糖的研究背景。自从研究者发现鼠李糖在细菌中广泛存在，但是在哺乳动物却十分罕见以来，鼠李糖及其生物合成途径的研究就引起广泛的关注。特别是从天然材料中分离获得以及化学法合成的含有鼠李糖的化合物在肿瘤免疫治疗，肿瘤杀伤和抗菌感染方面的应用报道以来，含有鼠李糖的化合物的研究成为热门课题。但是，这类化合物的获取还面临许多困难。研究者希望利用化学酶法获得上述化合物。本文围绕化学酶法合成化合物的两大要素，即底物和工具酶展开综述。首先，目前已发现的三种鼠李糖糖供体(dTDP-Rha，UDP-Rha和GDP-Rha)的生物合成途径均已被阐述，相关酶的功能以及部分酶的晶体结构已被报道。其中，dTDP-Rha是应用最广泛的鼠李糖供体，其生物合成途径中涉及四个酶，即葡萄糖-1-P胸苷转移酶RmlA，dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶RmlB，dTDP-4-酮-6-脱氧-3，5-差向异构酶RmlC和dTDP-4-酮-鼠李糖还原酶RmlD，它们的功能和晶体结构已被报道。其次，已有鼠李糖转移酶体外生化证据的报道，这些酶包括来自于嗜热脂肪芽孢杆菌、刺糖多胞菌、结核分枝杆菌、铜绿假单胞杆菌和肺炎链球菌等。但是，当前研究鼠李糖转移酶活性的两种主要方法，包括基因敲除法和异源表达酶并以同位素标记底物的方法，没有能够获得相关的产物。再次，本文总结了含有鼠李糖的化合物在疾病治疗方面的探索。另外，由于肺炎链球菌具有丰富的糖基转移酶，这些糖基转移酶参与肺炎链球菌荚膜多糖的生物合成，具有进一步开发成工具酶的潜力。因此，本文对肺炎链球菌的研究历史、荚膜多糖的合成途径和肺炎链球菌的糖基转移酶的研究现状进行综述。最后，提出本研究的内容及其意义。
第二，本研究建立了一种一锅四酶合成dTDP-Rha的新方法。为了解决已报道的dTDP-Rha制备方法中成本高和产率低的问题，本研究建立一种合成dTDP-Rha的新方法。(1)来源于23F型肺炎链球菌的、参与dTDP-Rha合成的四个酶，葡萄糖-1-P胸苷转移酶Cps23FL，dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶Cps23FN，dTDP-4-酮-6-脱氧-3，5-差向异构酶Cps23FM和dTDP-4-酮-鼠李糖还原酶Cps23FO分别被克隆、表达和纯化，体外获取均一的酶。(2)研究证明Cps23FL能够催化Glc-1-P和dTTP反应生成dTDP-Glc和PPi，具有胸苷转移酶的功能。(3)本研究对Cps23FL的酶学性质进行研究，包括初速度范围、最佳反应温度、pH、离子种类、离子浓度和酶促动力学常数。(4)研究证明Cps23FN能够催化将dTDP-Glc转化成dTDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖，具有dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶功能。(5)本研究对Cps23FN的酶学性质进行研究，包括初速度范围、最佳反应温度、pH和酶促动力学常数。(6)本研究证明Cps23FM和Cps23FO能够催化形成dTDP-Rha，分别具有dTDP-4-酮-6-脱氧-3，5-差向异构酶和dTDP-4-酮-鼠李糖还原酶功能。(7)本研究建立一种有效的、一锅四酶合成dTDP-Rha的方法，产率63％。
第三，本研究以Cps23FL/N/M/O酶法合成19个核苷二磷酸糖。核苷二磷酸糖是糖基转移酶所需要的糖供体，在糖基转移酶活性检测、化学酶法合成化合物和酶抑制剂开发等方面具有重要意义。但是，许多核苷二磷酸糖没有商品化，合成途径复杂，不易获得。本文开展dTDP-Rha的研究过程中发现，Cps23FL可被用来酶法合成核苷二磷酸糖。(1)Cps23FL底物特异性分析研究显示，该酶能够识别5种糖-1-磷酸(Glc-1-P,Gal-1-P，GlcNH-1-P，GalNH-1-P和Man-1-P)和八种天然（脱氧）核苷三磷酸（dTTP,UTP,ATP,dATP,CTP,dCTP,GTP和dGTP）作为底物，形成17种核苷酸糖(dTDP-Glc，dTDP-Gal,dTDP-GlcNH，dTDP-GalNH，dTDP-Man,UDP-Glc,UDP-Gal,UDP-GlcNH,UDP-Man,ADP-Glc,dADP-Glc,dADP-GlcNH,CDP-Glc,dCDP-Glc,GDP-Glc,GDP-Man和口dGDP-Glc)。除Cps23FL合成17个糖之外，加上如前所述的dTDP-Rha和dTDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖，本研究共合成19个核苷酸糖。(2)本研究构建八个Cps23FL突变株(Q24S、Q24V、Q80A、Q80E、Q80S、Q88A、Q88S和口Q88T)。其中Q88A催化Glc-1-P与UTP的反应比野生型Cps23FL提高了6倍。
第四，本研究提供确切的证据证明了cps23FT编码β1，4鼠李糖转移酶，并以Cps23FT催化体外合成了二糖产物Rhaβ-Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn。研究者预测Cps23FT是鼠李糖转移酶，参与23F血清型肺炎链球菌荚膜多糖重复单元的生物合成，但是受体底物的难以获得限制了该酶的研究。(1)来源于23F血清型肺炎链球菌的Glc-1-P转移酶的全长序列Cps23FE和C-端序列Cps23FECT被克隆和表达，既获得含有目的蛋白的细胞总膜，也通过纯化体外获取均一的目的蛋白。(2)本研究通过内源性底物和外源性底物UndP证明Cps23FE和Cps23FECT催化合成Glcα-PP-Und，具有Glc-1-P转移酶活性，并且完整的膜结构对酶的活性是必需的。但是，没有获得纯化的Glcα-PP-Und。(3)来源于23F型肺炎练球菌的鼠李糖转移酶Cps23FT被克隆、表达和纯化，体外获取均一的酶。(4)本研究通过化学合成获得Cps23FT的天然受体底物类似物Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn，并证明该底物可以被用来研究Cps23FT酶活。(5)本研究详细研究纯化的Cps23FT酶学性质，包括初速度范围、最佳反应温度、pH、离子种类、离子浓度和酶促动力学常数，为其生物学功能提供生化证据。(6)Cps23FT的底物特异性研究说明受体底物的焦磷酸和脂链部分是鼠李糖转移酶识别所必需的部分。(7)本研究通过构建和分析Cps23FT四个突变株（D97A，D99A，D271A和D273A），初步认为271DKD273是该酶结合金属离子位点。(8)本研究利用Cps23FT，以dTDP-Rha作为鼠李糖糖供体，以Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn作为糖受体，获得二糖产物Rhaβ-Glcα-PP-(CH2)11-O-Pn，产率为40％。
综上所述，本研究开展了源自23F型肺炎链球菌的鼠李糖转移酶及其相关酶的研究，具重要意义在于:(1)建立了有效合成dTDP-Rha和其它18种核苷二磷酸糖的新方法，对化学酶法合成化合物具有重要意义;(2)首次为源自23F型肺炎链球菌的dTDP-Rha合成酶、Glc-1-P转移酶和鼠李糖转移酶的功能提供了生化证据;(3)鼠李糖转移酶作为一种工具酶的表达和获得为化学酶法合成含有鼠李糖的化合物打下基础;(4)为酶法制备获取23F型肺炎链球菌荚膜多糖重复单元提供了基础，对后续的抗原表位研究、共同抗原筛选和新型疫苗研发具有重要意义;(5)本研究为研究肺炎链球菌荚膜多糖生物合成途径提供生化证据。