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免疫球蛋白结合蛋白（Immunoglobulin（Ig）-binding proteins,IBPs）是由细菌产生的特异性结合宿主抗体的蛋白,主要包括:金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcus aureus protein A,SpA）、链球菌蛋白G（Streptococcal protein G,SpG）和部分大消化链球菌表面蛋白L（Peptostreptococcus magnus protein L,Pp L）,是细菌重要的致病因子之一。IBPs作为天然的抗体结合分子,已被广泛应用于医学与生物领域,包括抗体纯化、抗体检测和免疫吸附治疗等。新型免疫球蛋白结合分子（Newly evolved lg-binding molecules,NEIBMs）是基于噬菌体展示体外分子进化技术,对IBPs中的各抗体结合域进行重组及突变改造,从而获得新分子结构和结合特性的抗体结合分子。SpA具有与IgG相关的医学和生物学领域的应用,包括病原抗体检测、IgG抗体的纯化、免疫沉淀等,这些应用主要依据SpA与抗体IgG Fc（Fc-Fc）高亲和力。SpA除了对IgG Fc的高亲和力之外,对IgG、IgM和IgA Fab的VH3区域具有低亲和力,这会导致IgG应用的复杂化。如何消除SpA的VH3结合能力并同时保留其Fc结合能力是蛋白质工程研究的重要挑战之一。本研究选择SpA A结构域中参与VH3结合的29、30位氨基酸以及C结构域中参与VH3结合的36、37位氨基酸进行了随机定点突变,并构建A29,30、C36,37随机突变组合噬菌体展示文库,分别应用未结合抗原和结合抗原的人IgG作诱饵对上述文库进行分子进化筛选,成地获得了具有IgG Fc结合活性并消除了IgM和IgA结合活性的NEIBM AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29 V3 0。本研究分为以下四个部分详细介绍:第一部分应用未结合抗原和结合抗原的人IgG为诱饵分子对A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库和A、C随机组合噬菌体文库进行体外分子进化实验室前期已成功构建A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库和A、C随机组合噬菌体文库,A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库的多样性和随机性以及两个文库的库容都满足后期体外分子进化的要求。应用未结合抗原和结合抗原的人IgG为诱饵分子,通过重复的“吸附”—“洗脱”—“扩增”一系列过程,对A29,30、C36,37突变组合噬菌体文库进行多轮筛选,获得优势组合:AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30。当用未结合抗原的人IgG为诱饵的常规筛选进化到第三代（F3代）时,加入SpA做为竞争蛋白同时进行竞争筛选,获得单克隆直接测序显示与常规筛选相同的优势组合:AL29I30-AV29K30。用未结合抗原的人IgG对未突变的组合文库进行体外进化筛选,获得优势组合A-A。第二部分体外分子进化所得A-A及其突变体的原核表达、纯化将优势组合重组序列A-A、AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30分别克隆于原核表达载体pET-32a（+）上构建3种重组的融合蛋白表达载体质粒p ET-32a（+）-A-A、pET-32a（+）-AL29I30-AV29K30和pET-32a（+）-AV29N30-AK29V30,转化到大肠杆菌表达菌BL21感受态细胞中,经过IPTG诱导后目的蛋白大量表达,再通过Ni-NTA柱亲和层析纯化获得目的蛋白。SDS-PAGE蛋白电泳定性分析目的条带大小约为32k Da。第三部分A-A及其突变体的抗体结合特性分析以ELISA实验为基础,通过蛋白标记辣根过氧化物酶（HRP）、生物素等手段,检测A-A、AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30与抗体IgG、IgM和IgA结合特性,发现AL29I30-AV29K30、AV29N30-AK29V30与A-A分子比较,保留了IgG的结合,消除了IgM、IgA的结合。同时,将AL29I30-AV29K30、AV29N30-AK29V30和A-A标记HRP,ELISA结果显示,HRP-AV29N30-AK29V30与IgG的结合能力最强,HRP-AL29I30-AV29K30结合能力次之,HRP-A-A与IgG的结合能力最弱。同时应用OCTET、SPR等实验验证了ELISA检测结果。第四部分A-A及其突变体的应用研究将HRP-A-A、HRP-AL29I30-AV29K30和HRP-AV29N30-AK29V30作为酶标二抗分子,用ELISA实验比较其对抗-HIV抗体、抗-EV71抗体和抗-CB3抗体的检测效果。对HIV阳性血清的检出率AV29N30-AK29V30最高,在抗-EV71VP1抗体、抗-CB3抗体的检测中,HRP-AV29N30-AK29V30敏感性最好,HRP-AL29I30-AV29K30次之,HRP-A-A最差。将蛋白AL29I30-AV29K30浓缩透析后制成偶联柱,AL29I30-AV29K30偶联柱与SpA偶联柱同时通过亲和层析纯化人血清,AL29I30-AV29K30亲和层析回收纯化IgG,未回收到可检测的IgM和IgA,因此证明了前者的应用优势。本研究中,基于噬菌体展示技术的体外分子进化获得了具有保留IgG结合活性且消除IgM和IgA结合活性的NEIBM AL29I30-AV29K30和AV29N30-AK29V30,并且在IgG纯化和检测中显示出实质性的应用优势。本研究是通过体外分子进化证明功能性蛋白质的一个成功实例,为开发高特异性、高亲和力的免疫球蛋白结合分子奠定了基础,也为SpA抗体结合特性的优化改造提供了一种有效的方法。