第一部分 RP2、COL2A1、PAX3、FOXL2基因变异分析　　 许多疾病的发生与遗传背景有关，研究这些疾病的遗传相关分子基础，有助于认识这类疾病的病因和发病机制并探索防治措施。本研究在课题组已拥有的眼遗传病资源库的基础上，应用DNA序列分析等分子遗传学技术，研究视网膜色素变性、中高度近视、Waardenburg综合征和小睑裂综合征的相关基因，寻找致病突变并分析基因型与表型的关系，为相关疾病诊断、预防及分子机制研究奠定基础。　　 第1章 X连锁视网膜色素变性(XLRP)与RP2基因突变　　 目的：在8个明确X连锁视网膜色素变性(XLRP)，已排除RPGR基因突变的先证者中寻找RP2基因突变，并研究其相关表型。　　 材料方法：从眼遗传病资源库中，选取8个XLRP的先证者及其家族成员，和185例无亲缘关系正常对照。对RP2基因的编码区进行直接测序分析。　　 第2章中高度近视与COL2A1基因多态的关联分析　　 目的：研究COL2A1基因多态与中国人群中高度近视易感性的关系。　　 材料方法：从眼遗传病资源库的大学生人群基因组DNA库中，选取383名双眼球镜超过-4.00D的中高度近视患者(病例组)和384名散瞳后双眼等效球镜在-0.50D～+2.00D的对照(对照组)。用直接测序方法对COL2A1基因的SNPsrs1635529、rs60542319、rs1635530、rs1635531、rs954326)进行基因分型，对两组间基因型分布、等位基因分布和单倍型分布进行统计分析(卡方检验)，P<0.01时认为有统计学差异。　　 结论：在我们所研究的人群内，COL2A1基因的rs1635529、rs60542319、rs1635530、rs1635531和rs954326等5个SNPs与中高度近视间未发现关联，不支持COL2A1基因多态与中高度近视易感性相关的报道。　　 第3章 Waardenburg综合征与PAX3基因突变　　 目的：研究国人Waardenburg综合征的PAX3突变特点及其表型特征。　　 材料方法：从眼遗传病资源库中，选取临床怀疑Waardenburg综合征的11个先证者，和100名无亲缘关系的正常对照。对PAX3基因的编码区进行直接测序分析。复杂突变经克隆测序证实。　　 结论：结果丰富了对PAX3突变频谱及基因型和表型相互关系的认识。　　 第4章小睑裂综合征(BPES)与FOXL2基因突变　　 目的：研究中国人群中小睑裂综合征患者中FOXL2突变类型及其相关特点。　　 材料方法：从眼遗传病资源库中，选取13个先天性小睑裂综合征家系的先证者及其家系成员，和100名无亲缘关系的正常对照。对FOXL2基因的编码区进行直接测序分析。并用限制性片段长度多态(RFLP)和异源双链-单链构象多态(HA-SSCP)进行家系中突变与疾病的共分离分析。对复杂突变进行克隆测序证实。　　 结论：结果丰富了对FOXL2突变频谱及基因型和表型相互关系的认识。　　 第二部分 RP2与NYX蛋白质相互作用研究　　 NYX基因(nyctalopin on chromosome X，OMIM300278)位于Xp11.4，编码有481个氨基酸残基的nyctalopin蛋白，属于SLRP(smallleucine-rich repeat proteins/proteoglycans)家族的一员。文献报道nyctalopin在视网膜组织主要分布在光感受器细胞与双极细胞相联系的外丛状层，参与视锥细胞和视杆细胞ON通道(ON-pathway)信号传导。NYX突变影响杆细胞ON通道正常功能，临床表现为先天性静止性夜盲(CSNB1,OMIM310500)。NYX突变所致的先天性静止性夜盲患者都有中高度近视(绝大部分为高度近视)，推测NYX突变直接参与诱导近视形成。迄今有11个基因突变可导致先天性静止性夜盲(RetNet: http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/)，多数基因突变所致CSNB患者不伴近视，说明近视的发生与先天性静止性夜盲无关，而与特定基因相关。NYX突变影响锥细胞ON通道，很可能与近视有关。　　 既往的研究发现，NYX突变除了会导致伴夜盲的高度近视外，还可以导致不伴夜盲的非综合征性高度近视。因此，研究nyctalopin蛋白的定位、以及与相近功能蛋白的作用，探索NYX基因突变导致近视形成相关通路，不仅有可能揭示突变nyctalopin诱发近视的分子机制，还为寻找其它近视相关基因提供线索。　　 GRM6基因(metabotropic glutamate receptor6，OMIM604096)位于5q35，编码有877个氨基酸残基的代谢型谷氨酸受体6(MGLUR6)。GRM6特异性在视网膜ON双极细胞表达。GRM6突变会导致常染色体隐性先天性静止性夜盲，视觉电生理变化为Schubert- Bornschein型并与NYX突变患者的视觉电生理变化相同、但与其它类型先天型静止型夜盲不同。GRM6突变所致先天性静止性夜盲患者常伴中高度近视。Nyctalopin和MGLUR6有许多共同点：都可以在视网膜双极细胞表达，都参与视网膜ON信号通路，突变均导致先天性静止性夜盲并多伴近视，视觉电生理改变相同。因此，研究这两个蛋白的表达及相互作用，有可能为揭示近视相关机制提供线索。　　 RP2基因(retinitis pigmentosa2,OMIM300757)位于Xp11,编码有350个氨基酸残基的RP2蛋白。RP2是细胞质膜相关蛋白，但是功能不明，其多肽N端与微管蛋白(tubulin)特异性伴侣蛋白co-factorC相似，C端功能域与NDK相似。RP2已被确认为X连锁视网膜色素变性(X-Iink RP)的一个致病基因。高度近视作为一种伴发症状，在NYX和RP2基因突变病人与许多其他表型共存。研究这两个蛋白的表达和相互作用，将有助于深入了解NYX和RP2的功能和致病机理，同时为研究高度近视病因及分子机理提供线索。　　 本课题从视网膜组织定位、细胞内定位、蛋白相互作用三个方面探讨NYX基因编码蛋白nyctalopin的功能。首先在小鼠和人视网膜组织通过免疫荧光染色研究nyctalopin蛋白的分布；然后在大鼠RGC5神经节细胞内研究内源蛋白定位，并且在RGC5表达nyctalopin重组融合蛋白并研究定位；最后通过细胞免疫荧光染色、免疫共沉淀、免疫印迹等分子生物学技术，寻找与nyctalopin相互作用的蛋白，结果发现RP2蛋白，MGLUR6蛋白是nyctalopin的两个相互作用蛋白，可能存在nyctalopin/RP2/MGLUR6蛋白相互作用网络。研究结果为揭示近视相关机制提供了有价值的线索。　　 第1章 NYX编码蛋白nyctalopin在眼球组织的定位研究　　 目的：研究nyctalopin在小鼠和人视网膜组织分布。　　 材料方法：小鼠和人的视网膜组织切片，应用免疫荧光化学染色技术，用nyctalopin抗体染色后荧光显微镜观察nyctalopin定位。　　 结论：本研究重新定位了nyctalopin在小鼠视网膜组织的定位，与以往报道主要分布在外丛状层(OPL)不同。本研究首次在人视网膜研究nyctalopin分布，结果发现其主要分布在光感受器的内节部分(IS)、外核层(ONL)和外丛状层(OPL)。虽然我们的观察结果尚有待进一步的使用多种不同的nyctalopin抗体予以证实，研究结果仍然丰富了我们对nyctalopin蛋白在视网膜组织中分布的认知，为进一步研究其蛋白质功能提供了依据。　　 第2章 Nyctalopin的细胞内定位研究　　 目的：探索内源性和重组融合nyctalopin蛋白在大鼠神经节细胞系RGC5的细胞内分布。　　 材料方法：在大鼠RGC5神经节细胞系用nyctalopin抗体免疫荧光化学染色后荧光显微镜观察内源性nyctalopin在细胞内的分布。体外构建融合蛋白表达重组体，克隆到带有红色荧光蛋白的载体pCS2-mRFP-N1上。共转染融合蛋白mRFP-nyctalopin表达质粒与绿色荧光标记的细胞色素c氧化酶蛋白EGFP-mito表达质粒(细胞色素c氧化酶分布于线粒体膜，用以标记线粒体)到RGC5细胞，24h后采用荧光显微镜活体直接荧光观察融合蛋白表达。应用免疫印迹检测融合nyctalopin的亚细胞定位。　　 第3章 nyctalopin相互作用蛋白的研究　　 目的：寻找能与nyctalopin相互作用的蛋白。研究nyctalopin与候选蛋白RP2,MGLUR6是否相互作用。　　 材料方法：以RGC5细胞为材料，应用免疫荧光染色技术和免疫共沉淀技术，从蛋白细胞内共定位和蛋白体外结合两方面研究nyctalopin与RP2蛋白，nyctalopin与MGLUR6蛋白是否存在相互作用。免疫荧光染色检测nyctalopin与RP2,nyctalopin与MGLUR6蛋白在RGC5细胞的定位分布。免疫共沉淀用RP2抗体从RGC5细胞裂解液中富集内源性RP2,检测蛋白复合物中是否存在nyctalopin和MGLUR6。进一步表达带有his标签的融合蛋白nyctalopin，免疫共沉淀用his标签抗体富集nyctalopin，检测洗脱蛋白复合物中是否存在MGLUR6。