胆固醇氧化酶是胆固醇代谢的关键酶之一，它催化胆固醇氧化及异构化反应，生成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢。胆固醇氧化酶被广泛应用于临床诊断、制药工业、食品加工及生物农药等方面，具有广泛的应用前景。本研究通过紫外+LiCl、紫外+光敏试剂处理类芽孢杆菌X534，筛选出一株酶活较高的诱变菌株XUM10，酶活为221.20 U.L^-1，比出发菌株提高了近2.5倍。此外对发酵工艺进行了改变，首先对突变株产酶条件进行了优化，确定了合适的产酶培养基及其组成，并对发酵温度、溶氧、pH等进行优化。在温度30℃，pH值为8，转速200r／min，摇瓶发酵50h，发酵液酶活达到275.41 U.L^-1。通过旋转蒸发浓缩、蔗糖浓缩、DEAE离子交换层析、SephadexG-75凝胶柱层析对该酶进行纯化，纯化后的浓缩酶液的酶活力达到6.83U／mg。通过SDS-PAGE电泳，测定酶的分子量为58KDa，以胆固醇为底物的米氏常数3.3×1O^-5mol／L，最大反应速度为4.60mmol／（L·min），显示了与底物良好的亲和性，从薄板层析结果看，转化产物单一，为有药用价值的胆甾-4-烯-3-酮。比较多种固定化酶的方法，最终确定固定化酶的材料为PVA+H₃BO₃+Na₂CO₃。并确定固定化酶最适温度为60℃，最适pH为7.0，其热稳定性及pH稳定性相对与游离酶有了很大程度的提高，通过电镜扫描观察固定化内部为小而密的多孔网状结构，使酶液很好的包埋在固定化材料内。通过固定化酶对牛奶中胆固醇的转化率试验，可知最高转化率为75.64％。