研究目的硫酸软骨素(chondroitin sulfate, CS)是一类硫酸化的糖胺聚糖,存在于细胞表面和哺乳动物的细胞外基质中,主要分布于软骨、骨、肌腱、神经组织和血管壁中。CS的基本结构是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1,3糖苷键连接形成的二糖,二糖之间以β-1,4糖苷键连接而成。CS具有抗炎、免疫调节、心脑血管保护、神经保护、抗氧化、细胞黏附调节等多种药理生理学活性与功能,且长期服用毒副作用小或无毒副作用。在欧洲、美国、东南亚、澳大利亚等国家,CS主要作为膳食补充剂或药品,用于心脑血管疾病、骨关节炎等疾病的预防与治疗。但是,由于其分子量大、亲水基团多、脂溶性差,体内吸收不完全,口服生物利用度低；在CS治疗心脑血管疾病的研究中,其降脂、抗动脉粥样硬化(AS)的疗效和量效关系以及其抑制斑块性的分子机制都尚不明确。为了解决这些问题,本研究拟对CS结构进行修饰改造,采用降低分子量、增加亲脂基团、构建两亲性纳米粒子等方法来改善其口服吸收效果,然后通过整体动物法筛选出肠道吸收效果好的CS衍生物,并采用Caco-2细胞模型对其促肠道吸收作用机制进行探讨；构建ApoE-/-小鼠AS动物模型,考察CS及其衍生物对AS斑块的抑制作用,并对其可能的抗AS作用机制进行探讨。研究方法1.具有两亲性的α-亚麻酸-低分子量硫酸软骨素结合物的制备及表征采用H202氧化降解法对CS进行降解,制备低分子量CS (LMCS),并采用亲脂性的α-亚麻酸(α-LNA)对LMCS进行修饰,合成出一系歹(?)α-LNA取代度不同的两亲性LMCS (α-LNA-LMCS)。采用红外光谱法(FTIR)、核磁共振波谱法(NMR)以及热差-热重分析法(TGA/DSC)对两亲性α-LNA-LMCS的结构进行表征；对两亲性a-LNA-LMCS的自组装及其自组装后的胶束的粒径大小、粒径分布、Zeta电位、表面形态、临界胶束浓度以及生物安全性等性能进行研究。2.CS及其衍生物的体内外肠道吸收及其机制研究采用整体动物模型考察CS及其衍生物的肠道吸收效果,筛选出肠道吸收效果好的α-LNA-LMCS;采用Caco-2细胞模型验证整体模型的研究结果,通过跨膜电阻的变化考察药物种类、浓度以及作用时间对Caco-2单层细胞完整性的影响；激光共聚焦显微镜观察CS及其衍生物在Caco-2细胞内的摄取和转运及其对Caco-2细胞F-肌动蛋白(F-actin)表达的影响,研究α-LNA-LMCS促进LMCS肠道吸收的作用机制。3.CS衍生物的抗动脉粥样硬化活性及其机制研究8周龄ApoE-/-小鼠104只随机分成8组(每组13只),高脂高胆固醇饮食(15%脂肪和0.25%胆固醇),同时进行药物干预,16周后用10%水合氯醛麻醉,心脏取血,制备血浆后生化法测定小鼠血浆中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量,考察药物对小鼠血脂的影响。ELISA法测定小鼠血浆中IL-6、TNF-α、C反应蛋白(CRP)的含量。通过对小鼠主动脉表面AS病变分析及主动脉根部病灶的苏木素-伊红(H&E)染色、油红O染色、Masson染色、巨噬细胞及平滑肌细胞免疫组化染色考察CS及其衍生物对AS斑块形成的影响；Western Blot法考察小鼠主动脉中p-NF-κB、p-JNK、p-ERK1/2、COX-2、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1等蛋白的表达情况。实时定量PCR法考察小鼠主动脉中IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1、 VCAM-1、ICAM-1等炎症相关因子基因的表达。从炎症调节方面探讨CS及其衍生物抗AS的分子机制。研究结果1.具有两亲性的a-亚麻酸-低分子量硫酸软骨素结合物的制备及表征合成了一系列α-LNA取代度不同的两亲性α-LNA-LMCS,并对其进行了表征。FT-IR、1H NMR以及TGA/DSC分析结果表明,α-LNA作为侧链通过与D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖糖环上的羟基形成酯键而连接到LMCS的主链上,α-LNA取代度在0.034-0.123的范围内；激光光散射仪、电位分析仪以及扫描电镜表征结果表明,α-LNA-LMCS胶束外观呈球形结构,水合粒径在78-117nm的范围内,Zeta电位在-30～-25mV之间,粒径大小适宜且粒径分布范围较窄；荧光光谱法考察a-LNA-LMCS自聚集性能的结果表明,a-LNA-LMCS能够在水溶液中形成较稳定的胶束,且a-LNA-LMCS胶束的临界胶束浓度在0.016-0.20mg/mL之间。2.CS及其衍生物的体内外肠道吸收及其机制CS及其衍生物的动物体内肠道吸收研究发现,LNA-LMCS2在血浆中的最高浓度Cmax、达峰时间Tmax、半衰期t1/2、体内总清除率CL以及曲线下面积AUCo-24分别为10.8±0.5mg/L、8.8±2.3h、18.8±3.1h、0.6±0.4L/(h-kg)以及12.0±0.6h,Cmax分别是CS和LMCS的2.8倍和1.6倍,t1/2是CS和LMCS的1.7倍和3.2倍,CL分别是CS和LMCS的0.18倍和0.19倍,AUC0-24分别是CS和LMCS的4.13倍和3.12倍,这些表明LMCS在经a-LNA修饰后肠道吸收效果得到显著的改善。Caco-2细胞模型研究发现,与CS及LMCS相比,LNA-LMCS2表观渗透系数Papp大(p<0.001)、外排率低(p<0.05), LNA-LMCS2可以抑制P-gp的活性,减少药物的外排,通过胞吞作用来促进增加LMCS的肠道吸收。对Caco-2单层细胞膜的跨膜电阻研究发现,LNA-LMCS2作用后,Caco-2单层细胞膜的跨膜电阻明显降低,通透性增加,这表明LNA-LMCS2可能打开了Caco-2单层细胞膜间的紧密连接。激光共聚焦显微镜观察发现,LNA-LMCS2可以影响F-肌动蛋白的微丝及骨架,打开细胞间紧密连接,增强细胞膜的通透性,且对单层细胞膜整体完整性没有影响。体内外实验研究表明,经a-LNA修饰后的LMCS可以通过促进胞吞作用和增加旁路吸收两种方式来提高LMCS的肠道吸收。3.CS衍生物的抗动脉粥样硬化活性及其机制药效学研究发现,8组间的小鼠体重未见统计学差异(p>0.05),这说明给药各组对实验动物的体重没有显著性的影响；与对照组相比,H-LNA-LMCS2组及H-LMCS组ApoE-/-小鼠血液中LDL-C和TG的浓度明显降低(p<0.05)；H-LNA-LMCS2组ApoE-/-小鼠血液中TNF-α、IL-6(?)(?)CRP的浓度显著降低。这些结果表明,LNA-LMCS2可以有效地降低AS模型中ApoE-/-小鼠的血脂浓度,并能够抑制机体的炎症反应。小鼠主动脉脉面病变分析(大体油红O染色)研究表明,与对照组相比,H-LNA-LMCS2组及H-LMCS组的病变面积明显降低,具有明显的统计学意义(p<0.01和p<0.05)；小鼠主动脉窦冰冻切片H&E染色和油红O染色研究表明,H-LNA-LMCS2组和H-LMCS组斑块面积／主动脉窦瓣环面积比值明显减少(p<0.001和p<0.05)；小鼠主动脉窦冰冻切片Masson染色表明,LNA-LMCS2及LMCS对给药各组斑块中胶原纤维含量影响不大,无统计学意义；小鼠主动脉窦冰冻切片免疫组化研究表明,与对照组相比,H-LNA-LMCS2组和H-LMCS组小鼠斑块中巨噬细胞的含量明显降低(p<0.05),平滑肌细胞明显升高(p<0.05)；高剂量的LNA-LMCS2及LMCS可以有效的抑制AS模型中ApoE-/-小鼠主动脉斑块的形成。Western blot及RT-PCR研究结果表明, LNA-LMCS2和LMCS能够通过下调磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK1/2)抑制p-NF-κB的核转位,下调COX-2、 MCP-1、VCAM-1、ICAM-1的表达,降低IL-6、TNF-α、MCP-1、VCAM-1、ICAM-1的mRNA水平。以上结果表明,LNA-LMCS2和LMCS的延缓AS斑块发展的作用可能是通过降脂和抗炎两条途径来实现的。结论和意义1.本研究成功的采用a-LNA通过酯化反应对LMCS进行了修饰,制备出了口服生物利用度良好的两亲性CS衍生物。2.两亲性LNA-LMCS2促进LMCS肠道吸收的作用机制研究表明,LNA-LMCS2可以通过促进胞吞作用和增加旁路吸收两种方式来提高LMCS的肠道吸收。3.高剂量(400mg/kg)的LNA-LMCS2和LMCS对ApoE-/-小鼠具有较好的降脂和抑制促炎酶及促炎因子的作用,可以通过降脂和抗炎两种途径来抑制ApoE-/-小鼠AS斑块形成及发展。4.本研究证明了两亲性LNA-LMCS2是一种具有良好口服生物利用度和抗AS活性的多糖衍生物,并确定了其部分药物活性作用机制。本课题的完成,不但为大分子多糖类药物的口服吸收改善研究提供一定的理论基础,而且为新型CS类抗AS药物的开发和利用奠定了基础,具有较好的应用开发前景。