褪黑素(MEL)和甲状腺素(TH)是绵羊季节性繁殖调控通路中的两个重要激素。MEL主要由松果体合成并分泌,在其过程中,5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(AA-NAT)和羟基吲哚-氧-甲基转移酶(HIOMT)是其最关键的两个酶。AA-NAT是合成过程中的限速酶,而HIOMT是全部过程中的关键酶。TH则来自于甲状腺的合成与分泌,并受促甲状腺素释放激素(TRH),促甲状腺素(TSH)的调控。最近在实验动物小鼠的研究中证实,甲状腺存在有合成MEL所必须的AA-NAT和HIOMT两个关键酶,并分布有褪黑素受体(MT1)。同时,在人和小鼠的甲状腺存在TRH及受体(TRHR),以及促甲状腺素β亚基(TSH-β)的剪接变体,暗示甲状腺本身可能存在对TH分泌自主调节的机制以及甲状腺合成的MEL可能参与了TH的合成调节。为了研究绵羊甲状腺能否通过MEL自主调控TH的合成,进而影响绵羊季节性繁殖,开展如下研究:1、利用RT-PCR技术检测MEL合成的关键酶基因AA-NAT和HIOMT,以及MT1和调控TH合成的相关基因TRH,TRHR,TSH-β,TSHR是否在绵羊甲状腺表达。在m RNA水平确定绵羊甲状腺能否自主合成且分泌MEL,并参与调控TH合成。结果表明:绵羊甲状腺表达MEL合成的关键酶基因和MEL受体基因,以及调控TH合成的基因TRH,TRHR和TSHR,但不表达TSH-β基因。2、通过双酶常规消化并分离得到甲状腺滤泡细胞,结合RT-PCR、细胞免疫荧光和ELISA技术,对培养的绵羊甲状腺细胞从形态,甲状腺特异性基因m RNA和蛋白的表达以及甲状腺素T3/T4的合成与分泌功能等方面进行鉴定,确定所培养的原代细胞功能完整性,建立绵羊甲状腺原代细胞培养体系。结果表明:成功地建立了简便可行的绵羊甲状腺细胞的原代培养方法。为深入研究绵羊甲状腺的功能提供了实验平台。3、采用组织免疫荧光,Western blot,ELISA等技术,验证绵羊甲状腺组织中MEL合成的关键酶基因AA-NAT、HIOMT以及MT1的表达,进而利用体外培养的细胞,在细胞水平验证绵羊甲状腺能否自主合成并分泌MEL,为进一步研究绵羊甲状腺自身合成并分泌的MEL与TH合成的关系打下基础。结果表明:绵羊甲状腺具有自主合成并分泌MEL的功能,绵羊甲状腺内部可能存在有通过MEL调控TH合成的新通路。4、运用组织免疫荧光,ELISA,q PCR技术,检测外培养的绵羊甲状腺原代细胞中TSH-β蛋白的表达,并用外源MEL对体外培养的绵羊甲状腺原代细胞进行处理,检测细胞培养基中T3/T4的水平和甲状腺细胞TPO的表达量。确定绵羊甲状腺自主合成并分泌的MEL是否调控TH的合成。结果表明:绵羊甲状腺组织不表达TSH-β蛋白,自主合成并分泌的MEL在体外细胞水平与TH的合成之间没有关联,但是在外源MEL的刺激下,TPO的相对表达量与对照组差异显著,表明MEL可能参与到甲状腺滤泡细胞的抗氧化过程。综上所述,我们的研究表明,绵羊甲状腺能够自主合成并分泌MEL,但绵羊甲状腺只部分表达通过MEL通路调控TH合成的相关基因,因此,甲状腺中合成的MEL可能不直接参与调控TH合成。但在外源MEL的刺激下,TPO的表达量增加,表明甲状腺自身合成并分泌的MEL可能参与到甲状腺细胞的抗氧化作用。甲状腺中合成的MEL是否参与绵羊甲状腺其它自分泌或者旁分泌调控,甚至对参与绵羊季节性繁殖调控还有待进一步验证。