论文部分内容阅读
本论文将碳纳米管(CNTs)和聚酰胺-胺(PAMAM)枝状高分子相结合,采用共价交联的方法制备了碳纳米管/聚酰胺-胺(CNT-PAMAM)复合物,并将其应用于基因质粒细胞内传输研究;采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、傅立叶红外光谱(FTIR)、紫外可见光谱(UV-vis)、荧光显微镜等分析测试技术,详细研究了碳纳米管/聚酰胺-胺复合物的微观形貌、分散性能、蛋白质/基因固载能力、细胞毒性、与细胞的相互作用及其作为基因载体的转染性能;并对影响转染效率的因素进行了初步探讨。在广泛的文献工作基础上,本论文开展了以下研究工作:1.简要综述了基因/蛋白质治疗的发展及目前存在的问题;对碳纳米管的结构、性质、功能化修饰及其在生物医学等领域的应用进行了概述。2.采用共价交联法将PAMAM修饰到多壁碳纳米管(MWCNTs)表面。对MWCNT-PAMAM复合物的形貌、分散性能等进行了表征;并详细研究了MWCNT-PAMAM对骨癌细胞(MG-63)的毒性以及其固载蛋白质和DNA的能力。结果表明:修饰到MWCNTs表面的PAMAM较密集,复合物在水溶液中有良好的分散性和稳定性。另外,复合物对MG-63细胞有很好的生物相容性,在一定浓度(<25μg mL-1)和培养时间(24 h)内,没有明显的毒性;与羧基化修饰的MWCNTs相比,MWCNT-PAMAM复合物对牛血清白蛋白和DNA(5’-Fam-CAAggTCgTgTAAAggTCAg-3’)的固载能力提高了约70倍,同时细胞毒性降低了大约30%。3.以所制备的MWCNT-PAMAM复合物作为绿色荧光蛋白基因质粒(pEGFP-N1)载体,研究了其对人宫颈癌细胞(HeLa)的转染性能。采用扫描电子显微镜、透射电子显微镜和紫外可见光谱表征了MWCNT-PAMAM与pEGFP-N1、Hela细胞的相互作用。TEM研究结果表明:MWCNT-PAMAM复合物具有较好的pEGFP-N1固载能力;MWCNT-PAMAM-pEGFP-N 1复合物能够有效地进入HeLa细胞内部。与羧基化的MWCNTs及纯PAMAM相比,MWCNT-PAMAM复合物转染pEGFP-N1的效率分别提高了约2.4倍和0.9倍;另外,在相同浓度下(25μg mL-1),MWCNT-PAMAM复合物的毒性比纯PAMAM降低了约38%。这些结果表明采用PAMAM修饰MWCNTs是一种既可以提高MWCNTs基因转染效率又可以降低其毒性的方法。4.采用PAMAM分别修饰三种不同的CNTs (L-MWNTs-1020、S-MWNTs-1020、L-SWNTs-1),并研究了所制备三种复合物对HeLa细胞的pEGFP-N1转染性能。初步评价了三种CNT-PAMAM复合物表面功能团数量、细胞毒性、碳纳米管的长度/直径大小与pEGFP转染效率之间的关系。结果表明:三种CNTs-PAMAM复合物均能成功地转染pEGFP-N1,但是转染效率有差别,其顺序为MWCNT-PAMAM-2> SWCNT-PAMAM-3> MWCNT-PAMAM-1。碳纳米管表面用于固定基因质粒的功能团(氨基)数量越多,转染效率越高;碳纳米管的参数尤其是长度和杂质也是重要影响因素之一,长度较短、聚集度低、杂质少的碳纳米管具有较高的转染效率。