论文部分内容阅读
目的课题组前期研究发现,美洲大蠊提取物具有抗肝纤维化作用,本课题以前期研究为基础,拟从性状、鉴别、检查和含量测定等方面对该部位进行研究。通过研究,建立美洲大蠊抗肝纤维化活性提取物(ML-HB,冻干粉)的质量标准,为美洲大蠊抗肝纤维化新药的研发奠定基础。方法1.采用薄层色谱、化学反应对ML-HB中的蛋白质、多肽、氨基酸、糖类、核苷类成分进行定性鉴别研究;2.参考《中国药典》2015年版和《新药审批办法》中的相关法规,对ML-HB中的水分、炽灼残渣、p H值、重金属、乙醇残留量、树脂残留进行常规检查,并研究其在不同溶剂中的溶解度;利用Tricine-SDS-PAGE电泳考察ML-HB的分子量分布;3.采用紫外-可见分光光度法测定ML-HB中总氨基酸和游离氨基酸的含量;比较Lowry(福林酚法)、BCA(2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠)、Bradford(考马斯亮蓝法)三种方法对多肽含量测定的影响,并优选出样品中多肽的最佳测定方法;采用硫酸-苯酚法对总糖含量进行测定,DNS(二硝基水杨酸)法对还原糖含量进行测定,从而确定多糖的含量;4.利用RPLC-DAD(反相液相色谱-二极管阵列检测器)技术对ML-HB进行分析,寻找最佳色谱条件,建立ML-HB的RPLC-DAD指纹图谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件对10批样品进行相似度分析,并利用SPSS19.0软件进行聚类分析。结果1.薄层色谱中美洲大蠊对照药材与ML-HB的相应位置上显相同颜色的斑点,斑点清晰,分离度好。蛋白黄反应中,样品溶液由浅黄变为橙黄,变色明显,证明样品中含有带苯环的蛋白质。PAS(过碘酸-希夫反应)显色时,样品显紫红色且稳定,变色敏锐,灵敏度高,表明样品中含有糖肽(粘多糖)类的成分。吲哚醌反应中,样品变为黄色,重复性好,证明样品中含有肽类成分。2.干燥失重法测得样品中水分含量在2.3‰～2.5‰;炽灼残渣法测得样品残渣量在2.4‰～2.6‰;样品的p H值在6.57～6.64;样品中重金属、乙醇残留量检查均符合《中国药典》2015年版要求;样品中残留树脂均未检出;溶解性研究表明样品在0.3%Tris溶液中溶解性最佳;通过含脲的Tricine-SDS-PAGE电泳可知,样品分离较好,Marker条带清晰,样品中少部分物质的分子量在1.2-45KDa之间,大部分物质分子量在1.2KDa以下。3.样品中游离氨基酸的平均含量为23.11mg/g,总氨基酸含量平均含量为63.54mg/g,线性关系良好(r=0.999 5),方法学考察符合要求。通过比较Lowry法、BCA法、Bradford法对多肽含量测定的影响,证明BCA法更适合样品中多肽的含量测定,多肽平均含量为381.0mg/g,线性关系良好(r=0.999 3),方法学考察符合要求。硫酸-苯酚法测得样品中总糖含量为50.50mg/g,线性关系良好(r=0.999 0),方法学考察符合要求;DNS法测得还原糖含量为13.49mg/g,线性关系良好(r=0.999 1),方法学考察符合要求,计算得多糖平均含量为37.01mg/g。4.建立了RPLC-DAD指纹图谱分析方法,确定了ML-HB中10个共有峰,并确定面积相对较大且稳定的5号峰为参照峰(S),方法学考察结果符合要求。10批样品共有峰的保留时间RSD值在0.73%～1.49%,表明指纹图谱建立的方法可靠、重现性良好。其峰面积的RSD在4.99%～40.59%,说明不同批号的样品成分含量存在差异。与共有模式R比较,相似度均大于0.823,聚类分析结果为:S1、S2、S3聚为一类,其余批次为一类。结论1.薄层色谱法斑点清晰,分离较好,ML-HB与对照药材主斑点大小、位置、色泽一致;蛋白黄反应、PAS、吲哚醌反应变色敏锐,重现性好,操作简便快速,专属性强,上述方法可用于ML-HB的定性鉴别。2.根据检查结果规定ML-HB中水分量、残渣量均不得高于3.0‰,p H值在6.2～7.0,重金属、乙醇残留量检查均符合《中国药典》2015年版要求;ML-HB中未检出残留树脂;样品应易溶于0.3%Tris溶液;课题建立的Tricine-SDS-PAGE电泳法能对ML-HB的分子量分布范围进行检测。3.建立了ML-HB中氨基酸、多肽、多糖的含量测定方法,并规定游离氨基酸含量不低于20.80mg/g,多肽含量不低于343.0mg/g,多糖含量不低于33.0mg/g。4.建立了ML-HB的RPLC-DAD指纹图谱。通过以上研究,建立了美洲大蠊抗肝纤维化活性提取物(ML-HB,冻干粉)的质量标准,为美洲大蠊抗肝纤维化新药的研发提供质量控制方法。