镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠血管重构的影响及其机制研究

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目的:本实验研究利用血液生化检测、组织形态学以及分子生物学等实验技术手段,观察镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠血管的Raf-1、MAPK P38、PCNA、PPAR GAMMA、Bcl-2蛋白和mRNA表达的变化,旨在探讨镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠血管重构的影响及其机制,为阐明镇肝熄风汤对自发性高血压的药理学机制、以及为中医经典方剂“镇肝熄风汤”治疗自发性高血压理论提供实验依据。材料与方法:50只15周龄SHR雄性大鼠,随机分成5组:模型组(生理盐水)、中药低剂量组(镇肝熄风汤)、中药中剂量组(镇肝熄风汤)、中药高剂量组(镇肝熄风汤)、复方罗布麻组,10只15周龄同源雄性WKY大鼠,作为正常对照组(生理盐水)。进行5周适应性饲养,实验开始前测定每组大鼠尾部动脉压,判断SHR遗传性高血压大鼠是否发病。实验开始,中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组灌胃给予中药镇肝熄风汤,模型组和正常对照组灌胃给予生理盐水,复方罗布麻组灌胃给予复方罗布麻,连续灌给药10周。1.10周给药后,采用无创血压测定大鼠尾部动脉压方法,无创血压计BP-98A测定大鼠尾部血压平均动脉压,清晨连续测定5天各组大鼠尾部动脉压。2.大鼠腹主动脉采血,放入促凝分离管中,凝固离心,Roche P800测定血清中胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)。3.取主动脉弓,4%多聚甲醛固定后,采用苏木素-伊红(HE)颜色进行组织形态学测定;TUNEL方法测定主动脉弓细胞凋亡变化。4.取主动脉弓,采用免疫印迹方法(Western-blotting)测定PPAR GAMMA、MAPK-P38、PCNA、Raf-1、Bcl-2蛋白表达变化,采用实时定量逆转录聚合酶链反应技术(Real Time RT-PCR),测定PPAR GAMMA mRNA、MAPK P38mRNA、PCNAmRNA、Raf-1mRNA、Bcl-2mRNA表达变化。结果:1.各组与模型组比较,平均动脉压(MABP)明显低于模型组(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,平均动脉压(MABP)无差异(P>0.01);中药低剂量组与正常组比较,平均动脉压(MABP)明显高于正常组(P<0.01)。2.各组与模型组比较,胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)有显著降低(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)有显著降低(P<0.05);中药低剂量组与正常组比较,胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)无明显变化(P>0.05)。3.主动脉弓切片HE染色表明,中药组与模型组比较,血管壁厚度减少,肌纤维和血管平滑肌细胞增生减少。4.各组与模型组比较,主动脉弓血管平滑肌细胞凋亡数量明显减少(P<0.01);中药中剂量组与中药高剂量组、复方罗布麻组比较,主动脉弓血管平滑肌细胞凋亡数量明显增多(P<0.01);中药高剂量组与复方罗布麻组比较,主动脉弓血管平滑肌细胞凋亡数量无明显变化(P>0.05)。5. Raf-1mRNA表达结果表明:各组与模型组比较,Raf-1mRNA表达显著升高(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,Raf-1mRNA表达显无明显变化(P>0.05)。6. MAPK P38mRNA表达结果表明:各组与模型组比较,MAPK P38mRNA表达显著升高(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,MAPKP38mRNA表达显无明显变化(P>0.05)。7. PCNA mRNA表达结果表明:各组与模型组比较,PCNA mRNA表达显著升高(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,PCNA mRNA表达显无明显变化(P>0.05)。8. Bcl-2mRNA表达结果表明:各组与模型组比较,Bcl-2mRNA表达显著升高(P<0.01);中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,Bcl-2mRNA表达显无明显变化(P>0.05)。9. PPAR GAMMA mRNA表达结果表明:各组与模型组比较,PPAR GAMMAmRNA表达显著升高(P<0.01);中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,PPAR GAMMA mRNA表达显无明显变化(P>0.05)。10. Raf-1蛋白表达结果表明:各组与模型组比较,Raf-1蛋白表达显著升高(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,Raf-1蛋白表达显无明显变化(P>0.05)。11. MAPK P38蛋白表达结果表明:各组与模型组比较,MAPK P38蛋白表达显著升高(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,MAPKP38蛋白表达显无明显变化(P>0.05)。12. PCNA蛋白表达结果表明:各组与模型组比较,PCNA蛋白表达显著升高(P<0.01);中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,PCNA蛋白表达显无明显变化(P>0.05)。13. Bcl-2蛋白表达结果表明:各组与模型组比较,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.01);中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,Bcl-2蛋白表达显无明显变化(P>0.05)。14. PPAR GAMMA蛋白表达结果表明:各组与模型组比较,PPAR GAMMA蛋白表达显著升高(P<0.01);中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、复方罗布麻组与正常组比较,PPAR GAMMA蛋白表达显无明显变化(P>0.05)。镇肝熄风汤可以激活Raf-1因子,活化的Raf-1因子激活下游的MAPK P38因子,活化的MAPK P38因子激活下游的PCNA、PPAR GAMMA和Bcl-2因子。结论:1.镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠的血压影响,具有良好的降压疗效,能够降低自发性高血压大鼠的血压。2.镇肝熄风汤对自发性高血压大鼠的血脂影响,具有降低血中胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)含量,能够降低自发性高血压大鼠的血脂,从而起到保护血管和降低血压的作用,减少血脂对血管的破坏。3.镇肝熄风汤能够有效的改善自发性高血压大鼠血管病理结构,减轻高血压对血管壁的损伤,从而起到保护血管的作用和减轻主动脉弓血管重构。4.镇肝熄风汤能够有效抑制自发高血压大鼠血管平滑肌细胞凋亡,减轻高血压对血管血管平滑肌细胞凋亡的影响和减轻主动脉弓血管重构。5.镇肝熄风汤能够上调自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞中Raf-1、MAPK P38、PCNA、PPAR GAMMA和Bcl-2的mRNA和蛋白表达,抑制主动脉弓血管平滑肌细胞凋亡和减轻主动脉弓血管重构。
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