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研究背景:心肌肥大是心脏重构的主要表现之一,是心肌缺血、心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病的独立危险因素。一氧化氮(nitric oxide,NO)作为体内重要的气体信号分子对心血管功能起到关键的调控作用,它可以通过调节蛋白质巯基亚硝基化修饰(S-nitrosylation)来发挥生物学效应。MLP(muscle lim protein)是一种在横纹肌特异性表达的蛋白质,它在多种心血管疾病中发挥着重要的作用,MLP在心肌肥大时是否发生疏基亚硝基化修饰,以及MLP的巯基亚硝基化修饰在心肌肥大中的作用及机制目前尚不清楚。研究目的:本研究利用AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型以及TAC术后小鼠心脏肥大模型探讨心肌肥大时MLP是否发生巯基亚硝基化修饰并探讨MLP巯基亚硝基化修饰在心肌肥大中的作用与机制。研究方法和结果:健康12周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)及其对照鼠(WKY)的心肌组织,胸主动脉缩窄术(TAC)后小鼠心肌组织,用Biotin-switch的方法特异性检测蛋白质巯基亚硝基化修饰水平,结果表明:在动物心肌肥大模型中,MLP的巯基亚硝基化修饰水平明显增加。新生乳大鼠原代心肌细胞给予100 nM血管紧张素Ⅱ(Angiotensin,AngⅡ)刺激24 h,用Biotin-switch的方法提取心肌细胞巯基亚硝基化修饰蛋白,结果表明:在心肌细胞肥大模型中,MLP的巯基亚硝基化修饰明显增加。提示心肌肥大时,MLP的巯基亚硝基化修饰增加。我们利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法筛选MLP发生修饰的位点,并进一步构建MLP特异性半胱氨酸位点突变的质粒,将MLP的半胱氨酸突变成丙氨酸,转染293T细胞,筛选MLP发生巯基亚硝基化修饰的位点,结果发现:MLP半胱氨酸25和79位点发生了巯基亚硝基化修饰。将MLP半胱氨酸C25、C79突变质粒包装腺病毒及野生型腺病毒(AdC25A、AdC79A、AdWT),感染乳大鼠原代心肌细胞,给予AngⅡ刺激,检测心房利尿肽(ANP)和脑利尿肽(BNP)基因表达反映心肌细胞肥大程度,以及α-actinin标记心肌细胞表面积,结果显示:将79位点突变后,可以明显改善由AngⅡ介导的心肌细胞肥大程度。而25位点突变后,对心肌肥大程度没有明显影响。接着我们用Ad C79A、Ad WT,感染原代心肌细胞,检测MLP与钙调磷酸酶(CnA)的结合能力,结果表明:在心肌细胞中,给予AngⅡ刺激可以明显促进MLP与CnA的结合,激活CnA/NFAT3信号通路促进心肌细胞肥大,但79位点突变后,MLP与CnA的结合能力减弱,其下游细胞核因子NFAT3(nuclear factor of activated T cells 3)的磷酸化水平增加,NFAT3调节的肥大相关基因的荧光素酶报告基因水平降低,抑制AngⅡ促心肌肥大的作用。结论:以上结果表明在肥大因子刺激下,MLP的79位半胱氨酸发生巯基亚硝基化修饰可以促进MLP与CnA的结合,激活下游CnA/NFAT3信号通路最终促进心肌肥大。