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线粒体是细胞能量代谢的主要场所,而线粒体呼吸电子传递链在线粒体的能量代谢中发挥着至关重要的作用,线粒体电子传递障碍将影响线粒体呼吸的氧化磷酸化过程和能量代谢,从而产生一系列的线粒体相关疾病。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)作为母系遗传的主要遗传物质,与核基因一同对线粒体的结构和功能进行调控,mtDNA多态性包括mtDNA的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)、单倍型、单倍群以及拷贝数变异(copy number variant,CNV)多种遗传变异。目前,已经发现mtDNA多态性与高原适应以及多种高原疾病都存在相关性。高原地区环境以低温低氧为主要特征,世居高原的人群往往对高原环境有了一定的适应,而适应不良的人群,易发生高原疾病。线粒体作为细胞能量代谢和缺氧适应的主要结构,其结构和功能的改变对高原适应及高原疾病的发生有重要的影响[1]。中国塔吉克族主要分布在帕米尔高原东部的新疆喀什地区的塔什库尔干县[2],世居高原已经数千年,总人数只有五万余人,在中国塔吉克族五十岁以上人群的高血压患病率调查中发现,其高血压患病率为39.2%,其对塔吉克族人群的健康产生着严重危害,目前对其机制研究缺乏[3-5]。本课题通过核基因和线粒体基因组测序,可以对中国塔吉克族的遗传特点和高原遗传适应有一个更加深刻的认识,从而为其高原疾病防治提供相应的指导和帮助。研究表明,mtDNA多态性与原发性高血压发病密切相关[6-8],例如mt15927G→A和mt7492C→T突变是原发性高血压的致病突变,mtDNA的16189T→C突变与9-BP(CCCCCTCTA)缺失,以及mt4401G和mt5821A的单倍型组合与家系研究中的原发性高血压相关,线粒体t RNA Ile的mt4263A→G突变与母系遗传性高血压也是存在相关的。但是mtDNA多态性和高原原发性高血压(high altitude essential hypertension,HAEH)易感性相关的研究还没有报道。高原低氧环境对线粒体的结构和功能都有着很大影响,mtDNA多态性与HAEH的相关性研究,可以揭示其遗传易感因素,还能寻找其相关分子机制。本文从mtDNA角度对中国塔吉克族人群的HAEH遗传易感因素进行了分析,并寻找其背后的遗传分子机制。研究方法:第一部分:1.在中国新疆喀什地区塔什库尔干县,采集中国塔吉克族HAEH全血标本53例,血压正常的对照组全血标本46例,并收集相关临床基本信息,标本经EDTA抗凝低温保存运送至陆军军医大学,提取全血DNA后进行相关遗传学研究。2.挑选1例健康成年男性,编号为T153,对其全血DNA标本采用高通量二代测序技术,对其核基因组数据的各类变异进行分析,筛选出与高原适应相关的单核苷酸变异(single nucleotide variant,SNV)、CNV。第二部分:1.设计扩增和测序引物,然后对53例HAEH组和46例对照组的DNA标本进行线粒体基因组的PCR扩增和测序。2.对标本进行筛选,将HAEH组53例样本和对照组46例样本的线粒体基因组测序数据进行统计分析,寻找存在统计学差异的mtDNA单倍群和SNP位点,找到与HAEH相关的遗传易感因素。第三部分:通过生物信息学软件来分析预测MTCYB(mitochondrial cytochrome B,线粒体细胞色素B)蛋白质的各级结构,寻找MTCYB的M316T突变与HAEH易感性相关的分子基础。实验结果:第一部分:T153全基因组测序结果显示,在高原适应相关的SNV、CNV方面,T153的高原适应相关基因SNV分布与藏族、埃塞俄比亚和安第斯山脉人群不同,表明其可能存在其它高原遗传适应机制,而T153基因DAZ的CNV均表现为减少,可能是中国塔吉克族男性人群性激素水平较低的影响因素。第二部分:在中国塔吉克族人群中发现,mtDNA单倍群亚群U4b是HAEH的易感因素,而mtDNA的SNP位点15693的T→C突变,导致MTCYB的316氨基酸由甲硫氨酸(Met)→苏氨酸(Thr)的错义突变,从而影响线粒体结构及其功能,可能是其主要的分子机制。第三部分:M316T突变会导致MTCYB一个新的蛋白激酶C磷酸化位点出现,使得相应的磷酸化反应Vmax值和Km值都增加,这可能是M316T突变导致MTCYB蛋白质结构功能变化,进而引起线粒体呼吸电子传递链功能障碍的一个重要因素,这可能是MTCYB(M316T)导致中国塔吉克族HAEH易感的分子机制。结论:1.中国塔吉克族T153的高原遗传适应机制与藏族、埃塞俄比亚人群以及安第斯山脉人群不同,可能存在其它机制,其DAZ基因拷贝数降低可能是中国塔吉克族男性激素水平较低的影响因素;2.mtDNA单倍群亚群U4b是中国塔吉克族HAEH的遗传易感因素;3.mt15693T→C突变引起MTCYB的316M→T突变,导致MTCYB蛋白质出现了一个新的磷酸化结合位点,从而影响线粒体复合体Ⅲ的结构功能,导致线粒体能量代谢异常,这一系列的分子结构功能改变,我们推测其可能是HAEH遗传易感的一个分子机制。