梨褐皮芽变果皮多胺代谢与相关基因克隆表达及pB1121-SPMS转化载体构建

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梨是一种营养丰富、深受人们喜爱的水果,其果皮色泽作为评价果实商品价值指标之一,向来极受关注。多胺作为一种重要的植物生长发育调节物质,参与植物生长发育的各个环节,并在植物抗逆性中也发挥着重要作用。为了探讨多胺在‘砀山酥梨’褐皮芽变品系‘锈酥’果皮褐色形成中的作用,试验以‘砀山酥梨’和‘锈酥’花后不同时期果皮为试材,采用HPLC方法测定了两者果皮中多胺含量,运用RACE技术克隆出多胺合成过程中相关基因,利用Protparam网站对基因进行生物信息学分析、通过MEGA5.0软件分析基因蛋白系统进化,并通过Real-time PCR技术分析其在不同时期果皮中表达差异;同时构建了多胺合成过程中SPMS基因的表达载体。试验获得主要结果如下:  (1)除花后50 d和150 d两个时期外,其它时期‘砀山酥梨’果皮中Put含量均显著高于‘锈酥’,花后不同时期‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中Spd、Spm均呈现先增加后降低的趋势。花后75 d时,‘锈酥’果皮中Spd和Spm含量明显高于‘砀山酥梨’果皮中的含量;Put在花后初期较高,随后有个降低升高再降低的过程,在花后75 d时‘砀山酥梨’果皮中Put含量要高于其在‘锈酥’果皮中的含量。  (2)以‘锈酥’cDNA为模板,利用RACE技术获得ADC、ODC、SPDS、SPMS和SAMS基因核苷酸序列。ADC基因序列全长为2193 bp,编码527个氨基酸,基因登录号为KM923903;ODC基因序列全长为1278 bp的全长,编码305个氨基酸,基因登录号为KP144199;SPMS基因序列全长为1110 bp,编码242个氨基酸,基因登录号为KM923906;SPDS基因序列全长为909 bp,编码221个氨基酸,基因登录号为KM923905;SAMS基因序列全长为1182 bp,编码521个氨基酸,基因登录号为KM923904。预测了编码蛋白的理化性质, ADC、SPMS、SAMS三个蛋白均为水溶性蛋白。ADC、ODC、SPDS、SPMS和SAMS基因的预测蛋白与苹果的亲缘关系最近,同源性分别为91.9%、96.6%、97.3%、90.8%、94.6%。  (3) ADC、SPDS、SPMS和ACL5基因在‘砀山酥梨’和‘锈酥’不同时期果皮中表达量结果表明,花后50 d时,多胺合成中相关基因在‘锈酥’果皮中表达量明显高于其在‘砀山酥梨’果皮中的表达量。ADC、SPDS和SPMS基因表达量均表现为先增加后降低的趋势,该结果与多胺含量变化趋势具有一致性,而ACL5基因变化和其它三个基因变化趋势不同,但在75 d时,其在‘锈酥’果皮中表达量要显著高于其在‘砀山酥梨’果皮中的表达量。  (4)以获得的SPMS基因全长为基础,在SPMS基因两侧分别引入了BamHI和XhoI酶切位点,成功构建了SPMS基因的表达载体,并成功转化农杆菌,浸染拟南芥花序,收集到种子。
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