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田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)是一种专性寄生于红细胞内的顶复门原虫,其分布广泛,可感染人以及小型啮齿动物。人感染后往往伴有高寄生虫血症,严重时会导致死亡,目前尚未研制出可有效防治田鼠巴贝斯虫感染的疫苗以及药物。糖基磷脂酰肌醇(GPI,Glycosylphosphatidylinositol)锚定蛋白是一类重要的顶复门原虫分泌蛋白,已被证实在虫体入侵宿主细胞中发挥黏附、锚定等重要功能,并且临床上已有针对这类抗原的商业化有效疫苗。因此本研究以田鼠巴贝斯虫GPI13和GPI17为研究对象,探究其在虫体入侵过程中所发挥的作用,为探明田鼠巴贝斯虫的入侵机制与相关疫苗的研发提供新的科学依据。本研究首先对田鼠巴贝斯虫GPI13和GPI17基因进行了克隆以及原核表达与蛋白纯化,随后对其黏附作用进行了研究,最后通过抗体中和试验初步评估其作为候选疫苗的潜力。具体工作包括以下几个方面:(1)Bm GPI13和Bm GPI17抗原性分析首先以田鼠巴贝斯虫c DNA为模板,克隆到全长为960 bp的Bm GPI13基因编码序列和全长为1371 bp的Bm GPI17基因编码序列。而后将其分别插入p GEX-6p-1原核表达载体,并将重组质粒转化入大肠杆菌Transetta中进行重组蛋白表达,分别从上清以及包涵体中纯化到重组Bm GPI13-GST蛋白以及Bm GPI17-GST蛋白。通过Western blot分析发现Bm GPI13-GST以及Bm GPI17-GST蛋白均可以被田鼠巴贝斯虫阳性血清识别,证明重组蛋白具有良好的反应原性。接下来使用重组蛋白进行了兔源多克隆抗体的制备,发现所制备的多克隆抗体可以特异性识别全虫抗原中的特异抗原,其中田鼠巴贝斯虫GPI13以及GPI17蛋白的天然蛋白大小分别为37 k Da和50 k Da左右。(2)Bm GPI13和Bm GPI17入侵功能鉴定红细胞黏附实验发现Bm GPI13不具备黏附宿主红细胞的能力,而Bm GPI17可以黏附宿主红细胞。对Bm GPI17红细胞黏附结构域的探索中发现其F3区域具备黏附宿主红细胞的能力,并且使用特异性抗体可以阻断Bm GPI17-F3与红细胞的黏附,说明Bm GPI17与红细胞的黏附是特异性的。Far-western实验发现Bm GPI17可能存在互作虫体蛋白参与入侵过程。抗体中和试验结果表明,针对Bm GPI13以及Bm GPI17的多克隆抗体在浓度为1 mg/ml时均与对照组差异显著,说明其可抑制虫体的生长。综上所述,本研究成功克隆并表达了田鼠巴贝斯虫GPI13和GPI17基因,通过红细胞黏附试验、抗体阻断黏附试验、Far-western以及抗体中和试验等对Bm GPI13以及Bm GPI17的功能进行了初步研究,确定了Bm GPI13以及Bm GPI17在入侵过程中发挥的作用,为探明田鼠巴贝斯虫的入侵机制与相关疫苗的研发提供了新的科学依据。